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内皮脂酶单基因多态性与冠心病的关联研究

作　者: 张黎
导　师: 严晓伟
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 内皮脂酶单核苷酸多态性冠心病关联研究单体型
分类号: R541.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景冠心病是由遗传和环境等多种因素导致冠状动脉粥样硬化(AS)而使血管腔狭窄阻塞导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的一种心脏疾病,其致死率高且发病率呈逐年上升趋势。目前的相关研究表明,血浆中较低的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与冠心病(CAD)的发病密切相关,而较高的HDL-C水平可以降低发生CAD的风险。血浆中的HDL-C浓度不但受到环境因素影响,而且具有高度的遗传性。而目前的遗传学研究提示,HDL-C的遗传异质性与调节HDL代谢的内皮脂酶(LIPG)的基因多态性有关。因此,本研究采用病例-对照的方法,对内皮脂酶基因的单核苷酸多态性(SNP)与冠心病进行群体关联分析,来探索冠心病的易感基因,对于开展有针对性地人群预防,延缓和防止冠心病的发生发展有重要意义。内皮脂酶(Endothelial lipase, EL)作为甘油三酯脂酶家族的成员,与脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase, LPL)、肝脂酶(Hepatic lipase, HL)具有高度的同源性,在脂质代谢特别是HDL-C代谢过程中起着非常重要的调节作用。内皮脂酶的主要活性为磷脂酶活性,HDL颗粒是其优先选择的底物。Ishida等人进行的小鼠体内试验表明,EL mRNA的表达与HDL-C水平之间存在明确的负相关；Badellino等人发现人体内血浆中的EL浓度与HDL-C水平之间存在显著负相关。内皮脂酶除了参与脂质代谢,它还与炎症反应密切相关。一方面,它参与内皮细胞黏附分子表达的调控,可能是通过影响内皮细胞黏附分子表达来参与动脉粥样硬化的病理生理过程的；另一方面,内皮脂酶的表达受到炎症反应相关细胞因子的影响,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-β(interleukin-p, IL-p)等可使内皮脂酶表达增加。因而推测EL可能参与了AS的形成和发展。目前,已有少量文献报道了在小样本特定种族人群中关于LIPG-C584T/ex3、T42C/in5两个基因变异位点的研究,结果表明携带这两个变异位点的人群与HDL-C水平相关。然而,在更大范围内的人群中,尚不清楚这些变异是否与血浆中的脂质水平及冠心病(CAD)相关。事实上,对于EL的研究尚处于初始阶段,目前关于EL基因多态性研究主要集中在与HDL胆固醇表型的关系上,而与冠心病关系的研究尚未有大样本报道,并且一些报道结论还存在不一致。基于以上研究背景,本论文针对居住在北京地区及其附近省市的中国汉族人群,采用大样本病例-对照的群体关联分析方法,来探究EL基因C584T/ex3和T42C/in5两个位点与血浆脂质水平及冠心病的相关性。研究目的(1)研究中国汉族人群冠心病患者和正常对照人群中内皮脂酶基因C584T/ex3和T42C/in5位点的变异情况,比较冠心病患者和正常对照人群之间两个位点基因型和等位基因频率的差异,探索内皮脂酶基因与冠心病的相关性；(2)分析中国汉族人群中内皮脂酶基因C584T/ex3和T42C/in5位点多态性与血浆脂质水平的相关性,进而探讨内皮脂酶基因在冠心病发病过程中发挥的作用。研究方法(1)本研究共入组了2007年1月至2009年4月在北京协和医院心内科心内科经冠脉造影确诊的冠心病患者941例,正常对照组为年龄匹配的同期协和医院体检非冠心病人群794例,所有研究对象均为汉族人群。收集并统计分析入组样本的血糖、血脂、冠状动脉病变情况等临床资料。(2)研究对象空腹8小时后采取静脉全血,EDTA抗凝,2000转离心10分钟分离血浆和血细胞,从单核细胞中提取DNA；(3)采用Taqman探针荧光定量PCR法对内皮脂酶基因C584T/ex3和T42C/in5位点进行基因分型,对上述两个位点的基因型进行遗传学分析；(4)对上述基因位点多态性与临床资料进行相关性分析；(5)用ELISA方法测定血浆中内皮脂酶的浓度,与血脂水平进行相关性分析。研究结果(1)本论文研究共纳入冠心病患者941例(中位年龄为62岁,男女人数比例为695：246),对照组794名例(中位年龄为60岁,男女人数比例为496：298),两组人群年龄匹配(P=0.083),性别存在显著性差异(P<0.001)。对两组人群进行危险因素分布的比较,发现高血压、糖尿病、高胆固醇血症、吸烟、冠心病家族史、肥胖、低HDL-C血症的比例在两组之间均有极显著差异,冠心病组均明显高于对照组。比较冠心病组和正常对照组的血脂、血糖、BMI、UA等计量临床资料,发现冠心病组的BMI、ALT、A1b、TG、HSCRP、FBG、UA水平高于对照组,而冠心病的HDL-C、ApoA-I、TC、LDL-C组低于对照组,以上指标在两组之间均存在显著性差异。(2)对研究中的冠心病患者和对照人群进行Hardy-Weiriberg平衡检验,结果表明两个SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡,P>0.05,这说明样本来自普遍人群。(3)内皮脂酶基因C584T/ex3和T42C/in5两个位点的基因型和基因频率在冠心病组和正常对照组之间无显著性差异；(4)对冠心病患者亚组与对照组进行分析,结果表明内皮脂酶基因C584T/ex3及T42C/in5两个位点的基因型和等位基因频率,在冠心病合并／不合并糖尿病患者和对照组之间、冠心病合并／不合并高血压患者和对照组之间、冠心病心梗患者／冠心病非心梗患者和对照组之间、早发冠心病患者和对照组之间、不同病变支数的冠心病患者之间以及不同狭窄程度的冠心病患者之间,均无显著性差异。(5)无论在男性人群还是女性人群中,内皮脂酶基因C584T/ex3及T42C/in5两个位点的基因型和等位基因频率在冠心病患者对照组之间无显著性差异。(6)内皮脂酶基因C584T/ex3和T42C/in5两个位点间存在连锁不平衡关系,形成3种频率大于3%的单体型；(7) C584T/ex3、T42C/in5位点形成的单体型与冠心病及心梗均无相关性；(8)对C584T/ex3、T42C/in5两位点分别进行单因素logistic回归分析,结果显示两位点变异与冠心病均无相关性；(9)分别对冠心病患者、正常人群、男性人群、女性人群中C584T/ex3位点的各基因型个体的血脂、空腹血糖、尿酸、BMI等计量资料进行比较,结果显示：在冠心病组、对照组、男性人群中C584T/ex3位点TT基因型的UA水平均高于CC型和CT型；其余指标在不同基因型之间则无显著性差异。(10)分别对冠心病患者、正常人群、男性人群、女性人群中T42C/in5位点的各基因型个体的血脂、空腹血糖、尿酸、BMI等计量资料进行比较,结果显示：在对照组人群中,T42C/in5位点CC基因型的ApoA-I水平高于TT型和TC型；在冠心病组、男性人群中T42C/in5位点CC基因型的UA水平高于TT型和TC型；其余指标在不同基因型之间则无显著性差异。(11)对EL浓度与年龄、性别、血脂、血糖、UA, BMI之间进行相关性分析,发现EL浓度与TG、BMI水平呈正相关(P<0.01),相关系数分别为0.238和0.149；EL浓度与HDL-C水平呈负相关(P<0.05),相关系数为-0.159。研究结论(1)未发现EL基因C584T/ex3、T42C/in5位点变异与中国汉族人群冠心病发病有显著相关性；(2)未发现EL基因C584T/ex3位点变异与中国汉族人群HDL-C以及其他血脂和脂蛋白具有显著相关性；(3)对照人群中,T42C/in5位点CC基因型ApoA-I水平高于TT型和TC型；(4)未发现内皮脂酶基因中C584T/ex3位点和T42C/in5位点构成的单体型与中国汉族人群冠心病发病有显著相关性；(5)血浆EL浓度与TG、BMI、HDL-C之间有显著相关性。

全文目录

缩写词表  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
第1章引言  15-19
  1.1 冠心病易感基因的研究方法  15-16
  1.2 高密度脂蛋白(HDL)研究  16
  1.3 内皮脂酶(EL)研究进展  16-19
第2章实验对象与材料  19-22
  2.1 临床实验对象  19
    2.1.1 样本来源  19
    2.1.2 实验对象  19
  2.2 主要试剂和试剂盒  19-20
  2.3 引物  20
  2.4 主要仪器设备  20-21
  2.5 主要试剂配制  21-22
第3章临床资料收集及临床特点的分析  22-27
  3.1 实验方法  22-24
    3.1.1 临床资料收集及指标检测  22-23
    3.1.2 统计学方法  23-24
  3.2 实验结果  24-27
    3.2.1 样本资料的收集  24
    3.2.2 人口学特征  24-25
    3.2.3 冠心病传统危险因素分析  25
    3.2.4 冠心病组和对照组之间临床资料分析  25-27
第4章 LIPG-C584T/ex3、T42C/in5与冠心病的关联研究  27-51
  4.1 LIPG-C584T/ex3和T42C/in5多态性研究进展  27-29
    4.1.1 国外相关研究进展  27-28
    4.1.2 国内研究进展  28-29
  4.2 实验方法  29-34
    4.2.1 标本的收集和储存  29
    4.2.2 基因组DNA提取试剂盒(溶液型)方法提取DNA  29-30
    4.2.3 DNA纯度及浓度的确定  30
    4.2.4 SNP测定  30-33
    4.2.5 酶联免疫吸附法(ELISA)测血浆内皮脂酶浓度  33
    4.2.6 统计分析  33-34
  4.3 实验结果  34-51
    4.3.1 DNA提取结果  34
    4.3.2 LIPG基因目的片断检测结果  34-35
    4.3.3 Taqman(?)探针法SNP分型  35-36
    4.3.4 基因型频率分布的Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验  36-37
    4.3.5 C584T/ex3及T42C/in5等位基因和基因型“病例—对照”关联分析  37-51
第5章讨论  51-57
  5.1 样本临床资料的收集  51
  5.2 单基因多态性分析  51-53
  5.3 EL基因C584T/ex3和T42C/in5单核苷酸多态性与冠心病的关联研究  53-55
  5.4 内皮脂酶浓度与血脂相关性分析  55
  5.5 内皮脂酶角色的进一步探索  55-56
  5.6 本研究的创新、局限和展望  56-57
第6章结论  57-58
论文参考文献  58-61
综述——内皮脂酶的研究现状  61-77
  综述参考文献  73-77
致谢  77-78
个人简历  78

内皮脂酶单基因多态性与冠心病的关联研究

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