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pSecTag-TAT-Bcl2l1质粒载体的构建与表达

作　者: 刘峭
导　师: 刘昌伟
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 内皮细胞凋亡和抗凋亡 Bcl-xl/Bcl211 基因修饰
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景：越来越多的研究提示内皮细胞凋亡在一些血管疾病(如血管术后再狭窄、动脉粥样硬化)的发生、发展过程中起到重要的作用。抑制内皮细胞凋亡,可能对加快受损血管内皮层的修复以及预防和治疗动脉粥样硬化具有重要意义。Bcl-xl/Bcl211蛋白作为抗凋亡蛋白在内皮细胞凋亡调节过程中发挥关键作用,因此,Bcl-xl基因治疗抗内皮细胞凋亡是一种可行的策略。通过分泌信号肽和穿膜肽序列修饰Bcl-xl基因,可能使编码的Bcl-xl蛋白具有分泌和穿膜功能,而增加Bcl-xl基因治疗抗内皮细胞凋亡的效果。目的：构建携带经信号肽和穿膜肽序列修饰的Bcl-xl基因的真核表达质粒载体pSecTag-TAT-Bcl211,并检测其转染内皮细胞后,融合蛋白的表达情况,为进一步研究融合蛋白功能及Bcl-xl基因治疗对内皮细胞抗凋亡的作用做前期准备。材料和方法：1.利用pSecTag2A质粒构建携带经信号肽和穿膜肽序列修饰的Bcl-xl基因的表达型质粒载体pSecTag-TAT-Bcl211。2. LipofectmineTM2000和EntransterTM-D介导的pSecTag-TAT-Bcl211转染EA.hy926细胞。3. pSecTag-TAT-Bcl211转染EA.hy926和293-T细胞,Weston Blot检测Ig K-chain Leader-TAT-Bcl211融合蛋白的表达。结果：1.成功构建pSecTag-TAT-Bcl211质粒。2. LipofectmineTM2000介导的pSecTag-TAT-Bcl211转染EA.hy926细胞,最高转染率为30%；LipofectmineTM2000介导的转染效率优于EntransterTM-D。3.在经pSecTag-TAT-Bcl211转染的EA.hy926和293-T细胞内,Weston Blot检测到Ig κ-chain Leader-TAT-Bcl211融合蛋白的表达。结论：1.成功构建pSecTag-TAT-Bcl211质粒。2. pSecTag-TAT-Bcl211能在血管内皮细胞内表达Igκ-chain Leader-TAT-Bcl211融合蛋白。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-10
实验材料  10-16
实验方法  16-33
  一.质粒载体pSecTag-TAT-Bcl211的构建  16-28
    1. Bcl211基因克隆  16-20
    2. 构建TAT-Bcl211融合基因  20-23
    3. TAT-Bcl211融合基因插入pSecTag2A质粒  23-28
  二.pSecTag-TAT-Bcl211的表达  28-33
    1. 细胞培养  28
    2. pSecTag-TAT-Bcl211的细胞转染效率  28-30
    3. Western Blot检测pSecTag-TAT-Bcl211的表达  30-33
实验结果  33-49
  一.质粒载体pSecTag-TAT-Bcl211的构建  33-43
    1. Bcl211基因克隆  34-36
    2. 构建TAT-Bcl211融合基因  36-37
    3. TAT-Bcl211融合基因插入pSecTag2A质粒  37-43
  二.pSecTag-TAT-Bcl211的表达  43-49
    1. pSecTag-TAT-Bcl211的细胞转染效率  43-45
    2. 细胞裂解液总蛋白浓度测定  45-46
    3. Western Blot检测pSecTag-TAT-Bcl211的表达  46-49
讨论  49-54
结论  54-55
后续实验构想  55-56
参考文献  56-59
综述  59-69
  参考文献  65-69
附录  69-70
致谢  70

pSecTag-TAT-Bcl2l1质粒载体的构建与表达

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