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冬凌草甲素及水飞蓟宾诱导人表皮癌A431细胞死亡机制研究

作　者: 于杨
导　师: 池岛乔
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药理学
关键词: 冬凌草甲素水飞蓟宾凋亡自噬活性氧(ROS) 表皮生长因子受体(EGFR) 一氧化氮(·NO)
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

冬凌草甲素是由天然药物冬凌草中提取出的一种二萜类化合物。之前的研究发现,冬凌草甲素可诱导肿瘤细胞发生凋亡。本实验选用人表皮癌A431细胞作为研究对象,进一步阐明冬凌草甲素抗肿瘤的作用机制。除凋亡外,冬凌草甲素还可诱导A431细胞产生自噬,且自噬对抗凋亡,发挥保护细胞的作用。药物的细胞毒作用与活性氧的产生密切相关。活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与冬凌草甲素合用可有效逆转冬凌草甲素诱导的细胞内活性氧生成增多、线粒体膜电位下降等作用；NAC可有效抑制冬凌草甲素引发的内源性及外源性凋亡的发生；同时,NAC也抑制了自噬的发生。非酶性清除剂谷胱甘肽(GSH)及酶性清除剂超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)被用来与冬凌草甲素共同作用,以检测其诱导产生活性氧的类型。结果发现,只有羟自由基(·OH)特异性清除剂GSH可有效清除冬凌草甲素诱导释放的活性氧并产生于NAC相似的保护细胞的作用,提示-OH可能是在冬凌草甲素诱导的细胞死亡过程中发挥主要作用的活性氧成员。试剂盒检测发现,冬凌草甲素可剂量依赖性降低细胞内GSH的含量。而加入-OH的供体Fenton试剂,则可模拟冬凌草甲素所诱发的一系列生物学效应。以上结果进一步证明了冬凌草甲素可能是通过诱导·OH的产生引发了A431细胞的凋亡及自噬。除凋亡外,另有报道表明酪氨酸激酶途径可能参与到冬凌草甲素诱导的细胞死亡过程中。由于A431细胞表面酪氨酸激酶家族中表皮生长因子受体(EGFR)高表达,因此,我们选用了EGFR的特异性抑制剂AG1478与冬凌草甲素共同作用,以考察药物诱导的凋亡与自噬同EGFR信号途径之间的关系。采用AG1478抑制EGFR途径后,可显著增强冬凌草甲素诱导的内源性及外源性凋亡；同时,还可加剧冬凌草甲素诱导的细胞线粒体膜电位下降及活性氧生成增多。NAC的加入可彻底逆转冬凌草甲素及AG1478所引发的活性氧增多及凋亡。AG1478的加入抑制了EGFR下游MAPK家族蛋白ERK, JNK及p38的活化。分别加入三种蛋白的抑制剂与冬凌草甲素共同作用,结果显示只有JNK的抑制剂SP600125可有效抑制冬凌草甲素诱导的活性氧增加与凋亡。研究发现,AG1478及SP600125均能有效降低冬凌草甲素诱导的自噬。由此我们判断：EGFR可能是通过激活下游的JNK途径促进自噬,借以对抗冬凌草甲素所诱导的细胞内活性氧增多及细胞发生凋亡。另外一种天然药物提取物水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性成分。由于其具有抗氧化的药理作用,水飞蓟宾在临床上常被用作保肝药。近年来,其抗肿瘤作用逐渐被人们所认识并深入研究。为进一步阐明水飞蓟宾的抗肿瘤机制并与冬凌草甲素的作用进行比较,我们研究了水飞蓟宾在A431细胞中对凋亡、自噬及活性氧产生等过程的影响。水飞蓟宾可时间剂量依赖性的造成A431细胞生长抑制；同时,其可诱导明显的自噬产生。在高剂量下(400μM),水飞蓟宾还可通过内外源途径诱导凋亡发生。在此剂量下,自噬对抗凋亡,竞争性的诱导细胞的死亡。虽然水飞蓟宾可诱导显著的线粒体功能损伤,但细胞内活性氧生成的减少说明水飞蓟宾在此过程中发挥的是抗氧化剂的作用。虽然可造成活性氧生成减少,但水飞蓟宾可剂量依赖性的诱导细胞内一氧化氮(·NO)产生增多。·NO的特异性清除剂PTIO的加入可有效保护水飞蓟宾所造成的细胞损伤,说明水飞蓟宾可部分通过促进·NO的产生诱导A431细胞发生凋亡及自噬。

全文目录

目录  7-10
中文摘要  10-12
Abstract  12-14
第一章绪论  14-54
  第一节细胞凋亡及其分子机制研究进展  14-23
    一、细胞凋亡的定义  14
    二、凋亡的发生过程  14-15
    三、凋亡的形态学特征  15
    四、凋亡的调控因素及信号转导途径  15-23
  第二节细胞自噬及研究进展  23-28
    一、自噬的定义  23
    二、自噬的分类  23-24
    三、自噬的发生过程  24-25
    四、自噬的调控因素  25-28
  第三节蛋白酪氨酸激酶研究简介  28-33
    一、蛋白酪氨酸激酶简介  28
    二、蛋白酪氨酸激酶分类与生理功能  28-33
  第四节活性氧及活性氮研究进展  33-36
    一、活性氧研究进展  33-35
    二、活性氮研究进展  35-36
  第五节药物简介  36-44
    一、冬凌草甲素的研究进展  37-40
    二、水飞蓟宾研究进展  40-44
  参考文献  44-54
第二章冬凌草甲素诱导人表皮癌A431细胞凋亡及自噬过程中活性氧的作用机制研究  54-84
  一、实验材料与方法  54-60
    1. 实验材料  54-55
    2. 实验方法  55-60
  二、实验结果  60-77
    1. 冬凌草甲素对A431细胞的生长抑制作用  60-61
    2. 冬凌草甲素诱导A431细胞发生自噬  61-63
    3. 活性氧清除剂NAC可有效抑制冬凌草甲素所诱导的A431细胞凋亡  63-65
    4. NAC可通过内源性及外源性途径抑制冬凌草甲素引起的A431细胞凋亡  65-67
    5. NAC抑制冬凌草甲素引起的细胞自噬  67-68
    6. 冬凌草甲素及NAC作用于A431细胞线粒体膜电位及细胞内活性氧产生的变化  68-69
    7. 羟自由基(·OH)在冬凌草甲素诱导的A431细胞死亡过程中其关键性作用  69-72
    8. 谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢酶(CAT)可抑制冬凌草甲素所诱导的A431细胞凋亡  72-74
    9. 羟自由基对A431细胞的作用  74-77
  三、讨论  77-80
  四、小结  80-81
  参考文献  81-84
第三章酪氨酸激酶抑制剂AG1478通过阻断JNK MAPK及增强活性氧产生促进冬凌草甲素诱导的人表皮癌A431细胞凋亡  84-107
  一、实验材料与方法  84-87
    1. 实验材料  84-85
    2. 实验方法  85-87
  二、实验结果  87-99
    1. 抑制表皮生长因子(EGFR)可促进冬凌草甲素诱导的A431细胞凋亡  87-89
    2. EGFR抑制剂AG1478可通过内源性及外源性途径加剧冬凌草甲素引发的细胞凋亡  89-90
    3. AG1478对冬凌草甲素造成的A431细胞线粒体膜电位下降及活性氧生成增多的影响  90-92
    4. 冬凌草甲素引起A431细胞内EGFR下游蛋白的变化  92-94
    5. JNK MAPK参与冬凌草甲素诱导的细胞凋亡  94-96
    6. AG1478及JNK抑制剂SP600125可降低冬凌草甲素诱导的细胞自噬  96-99
  三、讨论  99-103
  四、小结  103-104
  参考文献  104-107
第四章一氧化氮(·NO)生成在水飞蓟宾诱导的人表皮癌A431细胞凋亡及自噬过程中发挥调节作用  107-134
  一、实验材料与方法  107-111
    1. 实验材料  107-108
    2. 实验方法  108-111
  二、实验结果  111-125
    1. 水飞蓟宾对A431细胞的生长抑制作用  111-112
    2. 水飞蓟宾诱导A431细胞凋亡  112-114
    3. 水飞蓟宾诱导A431细胞产生自噬  114-116
    4. 水飞蓟宾诱导的自噬对抗凋亡,竞争性的促进A431细胞死亡  116-117
    5. 水飞蓟宾诱导A431细胞线粒体膜电位发生改变  117-119
    6. 活性氧不参与水飞蓟宾诱导的细胞死亡  119-121
    7. 水飞蓟宾可部分通过·NO的产生诱导A431细胞发生凋亡及自噬  121-125
  三、讨论  125-129
  四、小结  129-130
  参考文献  130-134
致谢  134-135
缩略语说明  135-137
附录  137-177

冬凌草甲素及水飞蓟宾诱导人表皮癌A431细胞死亡机制研究

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