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海参钙离子通道基因的克隆与性质分析

作　者: 杨冠科
导　师: 丛丽娜
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 海刺参电压依赖型钙离子通道 β亚基 RT-PCR 结构分析
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

电压依赖型钙离子通道（voltage-dependent calcium channel, VDCC）是细胞膜上控制Ca2+进入胞内的特殊蛋白质，VDCC β亚基具有调节其通道活性的作用。本文使用RT-PCR和RACE PCR技术，根据以海星、海胆等棘皮动物VDCC β亚基基因及其他多种无脊椎动物的VDCC β亚基保守序列为参考，设计简并引物，通过RT-PCR技术从海参中获得了443bp cDNA片段。根据已知的片段序列设计引物，利用3′RACE和5′RACE技术，获得了海参VDCC β亚基基因3′端的1019bp以及5′端的879bp。经拼接后成功地从海刺参（Stichopus japonicus）肠中克隆得到电压依赖型钙离子通道β亚基（SjCaβ）基因，所得序列提交GenBank，登录号为EU853658。该基因全长为1867bp，包含1个1614bp的开放阅读框（ORF），编码537个氨基酸。分子量预测值为59.8kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13。Dipro软件分析表明，在该氨基酸序列中共有3个半胱氨酸残基，其中Cys410和Cys428之间可能会形成一个二硫键。ProtScale程序运算的结果显示由此可以推测此蛋白可能为亲水性蛋白。将SjCaβ与多种无脊椎动物钙离子通道β亚基进行分析比较，发现它们有较高的同源性，并具有钙离子通道β亚基基因内保守的2个功能区域，即SH3功能区（src-homology3domain）和GK功能区（guanylate kinase domain）。在功能区域附近还具有电压依赖型钙离子通道β亚基特有的BID区（β interaction domain），氨基酸保守序列为PYDVVP--RP---VGPSLKGYEVTDMMQKALFDF，进一步确定了得到的cDNA序列为海刺参电压依赖型钙离子通道β亚基。本文对SjCaβ的二级结构进行了预测，构建了系统进化发育树，并运用同源建模法构建了SjCaβ的三维结构模型。结合三维模型可推测出Pro262，Pro266，Pro272和Tyr277这四个氨基酸残基为β亚基与α1亚基结合的关键位点。以上研究结果对深入研究海刺参离子通道的结构以及在信号传导过程中的作用有着重要意义，并为研究海刺参自溶等问题提供一定的理论基础。

全文目录

缩略词表  4-5
摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-28
  1.1 海参简介  12-15
    1.1.1 海参的分类  12-13
    1.1.2 海参的分布  13
    1.1.3 海参的养殖  13-14
    1.1.4 海参的成分  14-15
      1.1.4.1 营养成分  14
      1.1.4.2 生物活性物质  14-15
  1.2 离子通道  15-18
    1.2.1 离子通道的概念  15
    1.2.2 离子通道的研究进展  15-16
    1.2.3 离子通道的研究方法  16-18
      1.2.3.1 电压钳位技术  17
      1.2.3.2 单通道电流记录技术  17
      1.2.3.3 通道药物学研究  17
      1.2.3.4 通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术  17-18
    1.2.4 离子通道的分类  18
  1.3 钙离子通道  18-20
    1.3.1 电压依赖型钙离子通道  19
    1.3.2 受体依赖型钙离子通道  19-20
    1.3.3 池操纵型钙离子通道  20
    1.3.4 机械敏感型钙离子通道  20
    1.3.5 漏流钙离子通道  20
  1.4 电压依赖型钙离子通道  20-25
    1.4.1 VDCC 的基本功能及性质  21
    1.4.2 VDCC 的组成亚基  21-25
      1.4.2.1 α_1亚基  21-23
      1.4.2.2 β亚基  23-24
      1.4.2.3 α_2-δ亚基  24
      1.4.2.4 γ亚基  24-25
  1.5 本文的主要研究内容及意义  25-27
  1.6 本文采用的技术路线  27-28
第二章实验材料与方法  28-48
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 实验原料  28
    2.1.2 实验仪器  28-29
    2.1.3 实验试剂  29-30
    2.1.4 主要试剂的配制  30
  2.2 实验方法  30-47
    2.2.1 海参总 RNA 的提取  31
      2.2.1.1 实验药品的制备与器具的处理  31
      2.2.1.2 总 RNA 的提取  31
    2.2.2 RNA 电泳检测  31-32
    2.2.3 简并引物的设计  32-35
    2.2.4 SjCaβ cDNA 保守区域的 RT-PCR 扩增  35-40
      2.2.4.1 RT-PCR  35-36
      2.2.4.2 以 RT-PCR 产物为模板的二次 PCR  36
      2.2.4.3 PCR 产物的回收纯化  36-37
      2.2.4.4 重组质粒的转化  37-38
      2.2.4.5 蓝白斑法筛选阳性克隆  38
      2.2.4.6 菌落 PCR 检验  38-39
      2.2.4.7 产物的保存  39
      2.2.4.8 产物测序  39-40
    2.2.5 SjCaβ基因 3′末端未知序列的克隆  40-42
      2.2.5.1 引物设计  40
      2.2.5.2 反转录反应  40
      2.2.5.3 3′ RACE Outer PCR  40-41
      2.2.5.4 3′ RACE Inner PCR  41-42
      2.2.5.5 PCR 产物的回收纯化  42
      2.2.5.6 重组质粒的转化  42
      2.2.5.7 菌落 PCR 检验  42
      2.2.5.8 产物保存  42
      2.2.5.9 产物测序  42
    2.2.6 SjCaβ基因 5′末端未知序列的克隆  42-47
      2.2.6.1 引物设计  42
      2.2.6.2 去磷酸反应  42-43
      2.2.6.3 去掉 mRNA 的 5′帽子结构  43-44
      2.2.6.4 5′ RACEAdaptor 连接  44-45
      2.2.6.5 反转录反应  45
      2.2.6.6 5′ RACE Outer PCR  45-46
      2.2.6.7 5′ RACE Inner PCR  46-47
      2.2.6.8 PCR 产物的回收纯化  47
      2.2.6.9 重组质粒的转化  47
      2.2.6.10 菌落 PCR  47
      2.2.6.11 产物保存  47
      2.2.6.12 产物测序  47
  2.3 SjCaβ基因序列的生物信息学分析方法  47-48
第三章实验结果与分析  48-70
  3.1 海参肠总 RNA 的质量分析  48
  3.2 SjCaβ基因克隆  48-59
    3.2.1 SjCaβ保守区域 cDNA 的克隆  48-53
      3.2.1.1 RT-PCR 产物电泳分析  48-49
      3.2.1.2 二次 PCR 法扩增 RT-PCR 产物的电泳分析  49
      3.2.1.3 回收纯化 PCR 产物的电泳分析  49-50
      3.2.1.4 菌落 PCR 产物的电泳分析  50-51
      3.2.1.5 SjCaβ保守区域测序结果  51
      3.2.1.6 SjCaβ基因保守区域序列的 BLASTX  51-53
    3.2.2 SjCaβ 3′端 cDNA 的克隆  53-56
      3.2.2.1 3′ RACE Outer PCR 产物的电泳分析  53-54
      3.2.2.2 3′ RACE Inner PCR 产物的电泳分析  54
      3.2.2.3 3′ RACE PCR 割胶回收产物电泳分析  54
      3.2.2.4 菌落 PCR 产物的电泳分析  54-55
      3.2.2.5 3′ RACE 测序结果  55-56
    3.2.3 SjCaβ 5′端 cDNA 的克隆  56-59
      3.2.3.1 5′ RACE Outer PCR 产物的电泳分析  56
      3.2.3.2 5′ RACE Inner PCR 产物的电泳分析  56-57
      3.2.3.3 5′ RACE PCR 割胶回收产物电泳分析  57
      3.2.3.4 菌落 PCR 产物的电泳分析  57-59
      3.2.3.5 5′ RACE 测序结果  59
    3.2.4 SjCaβ基因全长序列  59
  3.3 SjCaβ基因的生物信息学分析  59-70
    3.3.1 SjCaβ基因的全序列特征分析  59-62
    3.3.2 序列比对和分子系统发育分析  62-65
    3.3.3 SjCaβ二级结构预测  65
    3.3.4 SjCaβ功能域分析及其三级结构模型  65-70
第四章结论  70-71
参考文献  71-77
致谢  77

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