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辽宁新品系绒山羊角蛋白家族基因的表达研究

作　者: 王艳杰
导　师: 金梅
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 动物学
关键词: 辽宁新品系绒山羊角蛋白家族实时荧光定量PCR RNA干扰技术
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

角蛋白家族基因主要包括角蛋白及角蛋白关联蛋白两大类基因，是羊绒的主要结构蛋白，与羊绒的优良品质密切相关。据相关研究证实，BMP信号通路是与毛囊生长相关的信号通路之一，能够间接调控毛囊生长，进而影响毛发类型及绒毛的直径。为了进一步研究角蛋白家族基因与羊绒的粗细度之间的关系，以及角蛋白家族基因与BMP介导的信号通路之间是否存在联系，利用实时荧光定量PCR技术检测K26、KAP26.1、KAP6.2、KAP7.1以及KAP8.2基因分别在兴盛期、退行期、休止期在毛囊中的表达量。利用半定量RT-PCR技术对上述5个基因在毛囊退行期皮肤组织、耳组织及毛囊生长期皮肤细胞中的表达情况进行了检测。利用RNA干扰技术，构建BMP信号通路抑制剂Noggin基因的慢病毒干扰载体，有效敲减羊皮肤细胞中Noggin基因，再次利用荧光定量PCR技术检测相关角蛋白家族基因的表达情况。实验结果如下：（1）荧光定量PCR结果显示：在毛囊兴盛期，KAP7.1、KAP8.2、KAP26.1及K26在次级毛囊中的表达量均高于初级毛囊（p<0.01）；进入毛囊退行期，这四个基因在初级毛囊中的表达量反而高于次级毛囊，其中KAP8.2的表达差异显著(p<0.05)，KAP26.1及K26的表达差异极显著(p<0.01)。而KAP6.2基因在初次级毛囊中的表达趋势与上述四个基因恰好相反。在毛囊休止期，皮肤中K26及KAP26.1基因的相对表达量较退行期时明显减少，其余3个基因与退行期时相似。（2）半定量RT-PCR实验结果显示，这5个基因在退行期皮肤、耳组织以及毛囊生长期皮肤细胞中的表达情况各不相同。KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP26.1这四个基因在上述组织中均表达，但表达量上存在差异。而K26基因仅在毛囊生长期皮肤细胞中有少量的表达。（3）RNA干扰实验结果：构建了特异性干扰Noggin基因的慢病毒干扰载体；抑制Noggin基因的表达后，对相关角蛋白家族基因的表达进行了荧光定量PCR检测发现，除KAP8.2基因外，KAP6.2、KAP7.1、K26及KAP11.1的相对表达量均呈下降趋势。由以上结果我们可以得出以下结论：1）KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、K26及KAP26.1在绒毛形成的不同时期在初、次级毛囊中及不同组织中的表达量是不同的，由此可以推断这些基因可能对绒毛生长的粗细度及毛囊的周期性变化有重要的调控作用。2）干扰Noggin基因的表达能够抑制相关角蛋白家族基因的表达。这些发现为今后继续研究BMP信号通路与角蛋白家族基因的联系提供了理论依据，也为今后改良绒毛品质及育种奠定了良好的基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10
1 实验背景介绍  10-19
  1.1 辽宁新品系绒山羊的概述  10
  1.2 角蛋白家族基因及其研究现状  10-12
    1.2.1 角蛋白  10-11
    1.2.2 角蛋白家族  11
    1.2.3 角蛋白家族基因的研究现状  11-12
  1.3 BMP 及其介导的信号通路  12-15
    1.3.1 BMP  12-13
    1.3.2 BMP 信号通路  13-14
    1.3.3 BMP 信号通路的研究现状  14-15
  1.4 RNA 干扰技术  15-18
    1.4.1 RNA 干扰原理及发现  15-16
    1.4.2 RNA 干扰技术的应用  16-18
  1.5 本研究的目的及意义  18-19
2 角蛋白家族基因在辽宁新品系绒山羊毛囊生长不同时期的表达研究  19-30
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 样本采集  19
    2.1.2 实验试剂及仪器  19-20
  2.2 实验方法  20-23
    2.2.1 初、次级毛囊的分离  20
    2.2.2 初、次级毛囊总 RNA 提取  20-21
    2.2.3 反转录 PCR 反应  21-22
    2.2.4 实时荧光定量 PCR 反应  22-23
  2.3 实验结果  23-27
    2.3.1 毛囊兴盛期总 RNA 提取  23-24
    2.3.2 毛囊退行期总 RNA 提取  24
    2.3.3 毛囊休止期总 RNA 提取  24-25
    2.3.4 实时荧光定量 PCR 实验结果  25-27
  2.4 讨论  27-30
    2.4.1 RNA 提取  27-28
    2.4.2 实时荧光定量 PCR 技术  28-30
3 利用半定量 RT-PCR 技术研究角蛋白家族基因在不同组织中的表达情况  30-39
  3.1 实验材料  30-31
    3.1.1 样本采集  30
    3.1.2 实验试剂及仪器  30-31
  3.2 实验方法  31-33
    3.2.1 辽宁新品系绒山羊毛囊生长期皮肤组织的获取  31
    3.2.2 辽宁新品系绒山羊毛囊生长期皮肤细胞的原代培养  31-32
    3.2.3 皮肤细胞传代培养  32
    3.2.4 毛囊退行期皮肤、耳组织以及毛囊生长期皮肤细胞总 RNA 的提取  32
    3.2.5 反转录 PCR 反应  32-33
    3.2.6 半定量 RT-PCR 反应  33
  3.3 实验结果  33-36
    3.3.1 辽宁新品系绒山羊毛囊生长期皮肤细胞  33
    3.3.2 RNA 提取  33-34
    3.3.3 RT-PCR 实验结果  34-36
  3.4 讨论  36-39
    3.4.1 实验结果讨论  36-37
    3.4.2 辽宁新品系绒山羊生长期皮肤细胞原代培养  37-38
    3.4.3 RT-PCR 实验  38-39
4 Noggin 基因慢病毒干扰载体的构建及干扰 Noggin 基因表达后相关角蛋白家族基因表达研究  39-74
  4.1 实验材料  39-41
    4.1.1 实验所用细胞，质粒及菌株  39
    4.1.2 主要试剂  39-40
    4.1.3 主要实验仪器  40-41
  4.2 实验方法  41-55
    4.2.1 慢病毒感染辽宁新品系绒山羊原代皮肤细胞的最佳 MOI 值摸索  41
    4.2.2 Noggin 基因干扰序列的设计  41-42
    4.2.3 RNA 干扰载体的构建  42-45
    4.2.4 Noggin 基因慢病毒干扰载体的构建  45-51
    4.2.5 Noggin 基因干扰慢病毒包装  51-52
    4.2.6 Noggin 基因干扰慢病毒感染靶细胞羊皮肤细胞后的 qPCR 干扰评价  52-54
    4.2.7 Noggin 基因干扰慢病毒感染羊皮肤细胞后相关角蛋白家族基因的 qPCR 检测  54-55
  4.3 实验结果  55-72
    4.3.1 慢病毒感染辽宁新品系绒山羊皮肤细胞的最佳 MOI 值  55-57
    4.3.2 Noggin 基因慢病毒干扰载体的构建  57-60
    4.3.3 Noggin 基因干扰慢病毒包装  60-61
    4.3.4 Noggin 基因干扰慢病毒的 qPCR 干扰筛选结果  61-65
    4.3.5 Lenti-EGFP-Noggin-3-miR 感染羊皮肤细胞后相关角蛋白家族基因 qPCR 检测结果  65-72
  4.4 讨论  72-74
    4.4.1 慢病毒载体的研究进展  72-73
    4.4.2 Noggin 基因敲减后相关角蛋白家族基因的表达研究  73-74
结论  74-75
参考文献  75-81
附录 A 角蛋白家族基因在毛囊不同时期荧光定量 PCR 的曲线图  81-91
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  91-92
致谢  92

辽宁新品系绒山羊角蛋白家族基因的表达研究

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