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芸香苷对家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的诱导表达研究

作　者: 张婷
导　师: 沈卫德
学　校: 苏州大学
专　业: 遗传学
关键词: 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因芸香苷实时荧光定量PCR
分类号: S881.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目昆虫的模式生物,芸香苷是一种植物次生物质,昆虫利用解毒酶系进行代谢是其适应植物次生物质的重要方式。本研究以家蚕为研究对象,对目前家蚕实时定量PCR研究中常用的内源参照基因进行分析,与双跟踪标定定量PCR方法进行比较。应用此方法,对芸香苷诱导后家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录水平进行了定量研究。本文的主要研究内容如下:1、实时荧光定量PCR中两种归一化方式的比较本实验采用双跟踪标定定量PCR方法,测定了BmGSTd1基因在正常饲养及添食芸香苷(5×10^-2 ng/μL)后在中肠和脂肪体中的转录水平。同时用目前常用的两种管家基因（Actin3 , GAPDH）作为内参对qPCR数据进行归一化,结果发现内参和外源参照基因标准化的结果差异很大;随后检测两种管家基因在正常情况下及芸香苷诱导后的转录水平。结果显示,二者在不同组织中的转录水平均不恒定,且在诱导后会发生变化。分析比较这些结果表明,管家基因在诱导后的表达不再恒定,而外源基因则不受实验条件的影响,能保证定量结果的准确性。选择加入外源参照基因对qPCR数据进行归一化处理,是家蚕诱导实验中检测基因表达的合适方法。2、不同浓度芸香苷溶液对BmGSTs基因的诱导作用采用双跟踪标定定量PCR方法,检测了添食不同浓度芸香苷溶液家蚕5龄幼虫的中肠和脂肪体中GSTs Omega家族不同基因的转录水平。结果显示,添食浓度为5×10^-2ng/μL的芸香苷溶液能诱导GSTs基因的转录水平发生显著变化:与对照相比,中肠中BmGSTo1、BmGSTo2和BmGSTo3基因在诱导后24 h的相对转录水平分别上升了7 141、1 391和3 398倍;在脂肪体中BmGSTo1的转录水平最高且在诱导后2 h达到最大值。与添食5×10^-2ng/μL芸香苷溶液处理组相比, 5×10^-1ng/μL芸香苷溶液诱导后脂肪体中各基因的转录水平上升的幅度较小并且达到峰值的时间不同,而添食5×10^-3ng/μL芸香苷溶液不能使BmGSTs基因的转录水平发生变化。3、芸香苷对BmGSTs基因的诱导作用本实验采用双跟踪标定定量PCR方法,用5×10^-2ng/μL浓度芸香苷溶液处理家蚕5龄幼虫,并对各组织中BmGSTs不同基因的转录水平进行检测。结果显示,在中肠中,BmGSTs1、BmGSTz2、BmGSTe1、BmGSTe2和BmGSTe6的诱导转录水平较高,在诱导后24 h达到最大值;在脂肪体中除BmGSTe2和BmGSTe5以外,其他GSTs基因的转录水平均很高且分别在诱导后2 h和4 h达到最大值;而在马氏管中除BmGSTs1能检测到转录水平小幅提高以外,其他基因的表达量均很低或者检测不到表达。结果提示,BmGSTs基因对芸香苷的代谢具有重要作用,对于进一步研究植物次生物质诱导作用对家蚕对杀虫药剂敏感度的影响具有重要的意义。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-12
第一章文献综述  12-27
  1.1 谷胱甘肽-S-转移酶  12-14
    1.1.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类  12-13
    1.1.2 谷胱甘肽-S-转移酶的结构  13
    1.1.3 谷胱甘肽-S-转移酶的功能  13-14
  1.2 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的研究进展  14-19
    1.2.1 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的分布  14
    1.2.3 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶基因在基因组的分布  14-16
    1.2.4 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的相关诱导物  16-17
    1.2.5 谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达调控机制  17-18
    1.2.6 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶的研究进展  18-19
  1.3 植物次生物质及其与昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的关系  19-21
    1.3.1 植物次生物质的分类  19-20
    1.3.2 植物次生物质与昆虫的关系  20
    1.3.3 植物次生物质与昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的相关研究  20-21
  1.4 实时荧光定量 PCR (Real-time PCR) 技术  21-23
    1.4.1 实时荧光定量 PCR 的原理及应用  21-22
    1.4.2 实时荧光定量PCR 的化学方法  22
    1.4.3 荧光定量 PCR 的定量方法  22-23
  1.5 内源参照基因在实时定量PCR 中应用的研究进展  23-25
    1.5.1 内参基因的作用  23-24
    1.5.2 常用的内参基因  24
    1.5.3 内参基因的稳定性研究进展  24-25
  1.6 双跟踪标定定量PCR  25-27
第二章实时荧光定量PCR 方法中两种归一化方式的比较  27-37
  2.1 材料与方法  28-30
  2.2 结果与分析  30-35
  2.3 讨论  35-37
第三章不同浓度芸香苷对家蚕GSTs 基因的诱导作用  37-44
  3.1 材料与方法  38-39
  3.2 结果与分析  39-43
  3.3 讨论  43-44
第四章芸香苷对家蚕 GSTs 不同家族基因的诱导表达  44-56
  4.1 材料与方法  45-47
  4.2 结果  47-54
  4.3 讨论  54-56
结论  56-57
参考文献  57-67
附录  67-68
攻读学位期间发表的论文  68-69
致谢  69-70

芸香苷对家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因的诱导表达研究

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