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YHem1基因转化香蕉提高其抗冷性的研究

作　者: 韩丽晓
导　师: 汪良驹
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 香蕉薄片 YHem1基因 ALAS(ALA合酶) 转基因叶绿素荧光低温胁迫
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

香蕉是世界上最重要的热带和亚热带经济作物之一。低温是影响香蕉品质、产量及种植范围的重要限制因子。栽培香蕉多为三倍体,芥能形成可育的种子,因而,通常只能依靠无性繁殖。这一特殊的生物学特性使其很难利用传统的实生育种方法进行遗传改良。相反,近年来组织培养技术和基因工程技术的出现使香蕉的品种改良得以实现且更加容易。人们早就发现,在植物体内普遍存在着5-氨基乙酰丙酸(ALA)。上世纪末,国内外学者研究发现,低浓度ALA能够调节植物生长发育,提高作物产量,增强作物抗逆性。前人创造性地将拟南芥HemA1基因光敏型启动子与酿酒酵母菌ALA合酶编码基因Hem构建在一起,形成一个光控制的Hem1基因(YHem1)。将YHem1转入烟草、拟南芥以及草莓等作物中,可以提高植物叶片光合能力,增加植株耐盐性。但是YHem1是否能够转入香蕉,并且提高植株耐冷性的研究尚未见有报道。本研究拟将YHem基因转入香蕉假茎薄片中,通过优化再生体系和遗传转化体系,筛选抗性不定芽,通过GUS染色与分子检测,获得转基因香蕉植株。所获得的主要结果如下。1以‘巴西’香蕉(Musa nana cv.’Brazil’)假茎横切薄片为外植体,通过对植物生长调节剂、外植体和暗培养时间比较,优化了香蕉不定芽再生体系。实验结果表明,本实验条件下香蕉薄片再生率最高可达到95%,首先要选择5代以前的香蕉植株,其次在MS基本培养基中附加0.1mg/L NAA、3mg/L6-BA和2.0mg/LAgNO3,最后要经过2周的暗培养时间。将得到的长至2-3cm的不定芽切下置于MS+0.4mg/LNAA的生根培养基中生根可得到完整的植株。2在上述再生体系基础上,研究了影响香蕉遗传转化的几个因素,如：浸染辅助方法、Km浓度以及共培养条件等,优化了香蕉遗传转化体系。研究结果表明：在含有拟南芥HemAl基因启动子控制的酿酒酵母ALA合酶基因(Hem1)质粒的农杆菌液(OD600=0.8-1)中侵染30min(震荡侵染10min后静置20min),且在添加100nmol/LAS和2mg/LPro的共培养基中暗培养4-6d,250mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素筛选3周,获得了7株卡那霉素抗性植株。3利用以上实验得到的香蕉再生和遗传转化体系,共得到15个抗性芽(抗性芽再生率约为20%),7株香蕉抗性苗,经GUS染色检测得到5株GUS+植株；经PCR凇测证明3株苗同时转入了HemA1启动子基因和Hem1目的基因；经过RT-PCR检测YHemI在其中的2株中得到过量表达。内源ALA含量测定表明,转基因植株可以过量合成ALA,其内源ALA含量显著高于野生型植株。4对转基因植株与野生型植株在25℃常温和7℃低温胁迫1.5h后的香蕉叶片叶绿素相对含量(SPAD)、快速叶绿素荧光诱导曲线(OJIP)及820nm光吸收曲线分析结果发现,转基因植株的SPAD值显著高于野生性植株。低温胁迫后,野生型的OJIP相明显下降,但转基因株系各相仍保持了较高的荧光值；利用多功能植物效率仪(M-PEA)测定结果表明,低温胁迫前后,转基因香蕉叶片单位面积吸收的(ABS/CS).捕获的(TRo/CS).传递的(ETo/CS)能量以及光合性能指数(PIABS和PIcs)均高于野生型；低温胁迫后,PSI反应中心的氧化速率和再还原速率均不同程度的高于野生型,同时以热量形式耗散的能量(DIo/RC)下降,这些都表明过量合成ALA保护了逆境条件下香蕉叶片光合电子传递和能量转换,保护光合产物的积累,也就是提高了香蕉植株的抗低温能力。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-13
引言  13-15
第一章文献综述  15-35
  1 香蕉的种植  15
  2 氨基乙酰丙酸(ALA)的出现  15-24
    2.1 ALA在植物体内的生物合成途径  16
    2.2 ALA的生物合成  16-19
    2.3 ALA的生物功能及其研究价值  19-23
    2.4 ALAS的基因工程研究国内外进展  23-24
  3 香蕉转基因研究进展  24-33
    3.1 香蕉再生体系的研究  24-27
    3.2 遗传转化体系的建立  27-32
    3.3 香蕉转基因研究进展  32-33
  4 实验目的与意义  33-35
第二章香蕉茎尖薄片不定芽再生体系的优化  35-41
  摘要  35
  ABSTRACT  35
  1 材料与方法  35-36
    1.1 材料  35
    1.2 植物生长调节物质配制  35-36
    1.3 不定芽诱导试验设计  36
    1.4 不定芽生根  36
    1.5 数据统计  36
  2 结果与分析  36-38
    2.1 NAA与6-BA不同浓度组合对香蕉假茎薄片再生的影响  36-37
    2.2 暗培养时间对香蕉薄片不定芽再生的影响  37-38
    2.3 生根  38
  3 讨论  38-41
第三章香蕉茎尖薄片遗传转化体系的优化  41-49
  摘要  41
  ABSTRACT  41-42
  1 材料和方法  42-45
    1.1 材料  42-44
    1.2 方法  44
    1.3 遗传转化步骤  44-45
  2 结果分析  45-47
    2.1 浸染过程中震荡辅助方法对香蕉GUS瞬时表达的影响  45
    2.2 AS、Pro对抗性芽再生的影响  45-46
    2.3 Km对叶片不定芽再生的影响  46-47
  3 讨论  47-49
第四章香蕉抗性幼苗的分子检测  49-57
  摘要  49
  ABSTRACT  49-50
  1 材料和方法  50-53
    1.1 材料  50
    1.2 方法  50-53
  2 结果与分析  53-56
    2.1 抗性‘巴西’香蕉芽的GUS组织染色检测  53-54
    2.2 抗性‘巴西’香蕉植株的PCR检测  54-55
    2.3 抗性‘巴西’香蕉植株的RT-PCR检测  55
    2.4 转基因香蕉株系ALA合酶活性和内源ALA含量  55-56
    2.5 抗性芽生根与移栽  56
  3 讨论  56-57
第五章转ALAS基因香蕉叶片快速叶绿素荧光特性对低温胁迫的响应  57-67
  摘要  57
  ABSTRACT  57-58
  1 材料与方法  58-59
    1.1 材料  58
    1.2 方法  58-59
    1.3 JIP-test分析  59
    1.4 数据统计分析  59
  2 结果与分析  59-64
    2.1 不同株系香蕉叶片叶绿素相对含量的影响  59-60
    2.2 转基因香蕉叶片快速叶绿素荧光诱导动力学分析  60
    2.3 低温胁迫对香蕉叶片Vj、Vi、ψ_0和φE_0的影响  60-61
    2.4 低温胁迫对香蕉叶片φP_0、PI_(ABS)、PI_(CS)、RC/CS的影响  61-62
    2.5 低温胁迫对香蕉叶片PSⅡ反应中心能量吸收、捕获及电子传递效率的影响  62-63
    2.6 低温胁迫对香蕉叶片PSⅠ在820nm吸收曲线变化的影响  63-64
  3 讨论  64-67
全文结论  67-69
本文创新点  69-71
参考文献  71-83
附录  83-85
在读期间发表的论文  85-87
致谢  87

YHem1基因转化香蕉提高其抗冷性的研究

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