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香蕉MaMYB基因克隆及抗旱功能研究

作　者: 邢文婷
导　师: 金志强
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 香蕉拟南芥 MaMYB转录因子基因克隆非生物胁迫表达分析
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

香蕉是一年草本植物,喜高温多湿,缺水时叶片变薄、生长滞后,产量降低。由于香蕉产量常受各种胁迫因子的影响,因此研究非生物胁迫下植物基因的表达情况,有助于我们了解其抗逆的真正机理,为抗逆性品种的选育提供理论基础。有研究显示,植物MYB转录因子参与响应植物各种生物或非生物胁迫,对植物的生长发育和抗逆性等方面具有重要的作用。本实验室前期从香蕉根系(Musa acuminate L.AAA group cv. Brazilian)的cDNA文库中获得了一个MYB基因,命名为MaMYB.为了进一步丰富香蕉MaMYB转录因子基因资源,初步预测MaMYB基因结构、功能。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR技术从香蕉根系中克隆了MaMYB,该cDNA序列的开放阅读框为951bp,编码316个氨基酸,分子量为35.08Kd。通过与其他物种MYB转录因子同源氨基酸序列比对发现,N端MYB结构域保守性较强,全长序列相似性则较低。进化树分析表明,MaMYB与山羊草RAX3聚类同一分支上,二者的亲缘关系较近。保守结构域分析表明,MaMYB转录因子具有2个SANT结合域,在C端含有转录调控区,属于典型的R2R3-MYB转录因子。2.在包括干旱、高盐、低温及四种不同激素[脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸(MeJA)]胁迫下,荧光定量PCR分析表明,在PEG、NaCl处理后,MaMYB表达量明显增加,而在低温胁迫下表达量无明显变化；四种外源激素处理后,该基因被诱导表达且极显著。说明MaMYB表达受干旱、盐胁迫和信号物质胁迫诱导。3.将MaMYB全长cDNA序列插入植物表达载体35S::GFP (pCAMBIA1304-GFP)中,获得绿色荧光融合蛋白载体35S::MaMY8-GFP,农杆菌介导转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明MaMYB被定位于细胞核中。4.将已获得的植物表达载体35S::MaMYB-GFP转化野生型拟南芥,以转化35S::GFP植物表达空载体的拟南芥(VC)作为阳性对照,分别得到转化的纯合株系13株和7株,野生型拟南芥为阴性对照(WT)。分别选取转化目的基因、阳性对照和阴性对照各48株进行抗旱性实验。结果表明过量表达MaMYB的转基因株系存活率较WT、VC显著提高。对转基因和WT、VC拟南芥的表型分析发现,转基因拟南芥的主根普遍比WT、VC长,叶片厚而小,边缘卷曲。在不同甘露醇浓度处理下,随着浓度的增大,各株系发芽率下降,但转基因种子的发芽率仍较WT、VC高。5.生理指标测定显示,控水后,转基因拟南芥丙二醛含量显著低于WT、VC;表明MaMYB过量表达降低了生物膜的膜质氧化作用程度,减少丙二醛含量的积累。转基因拟南芥总超氧歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)酶活性显著高于野生型和VC,显示这三种酶活性共同协作,从而提高的转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性。6.定量荧光PCR分析MaMYB依赖于ABA信号转导途径应答基因RD22、RD29B、RAB18和不依赖于ABA信号转导途径RD29A、DREB2A在转基因、阳性对照、阴性对照中在干旱胁迫下的表达,分析显示转基因株系应答基因的表达量高于WT、VC株系,说明MaMYB通过增强胁迫应答基因表达提高植物对干旱胁迫的耐受性。综上所述,香蕉MaMYB转录因子参与植物的耐旱胁迫反应,其超量表达通过改变植株的形态、调控ABA途径相关基因的表达,增强转基因植物的抗旱性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
上篇文献综述  11-25
  1 香蕉简介  11-12
    1.1 香蕉生产的重要性  11
    1.2 香蕉抗逆品种改良的重要性  11
    1.3 香蕉抗性基因功能的研究现状  11-12
  2 植物MYB转录因子的研究  12-17
    2.1 MYB转录因子进化及其相关蛋白  13-14
      2.1.1 MYB转录因子进化  13
      2.1.2 MYB结构分类与相关蛋白  13-14
    2.2 植物MYB转录因子的生物学功能  14-17
      2.2.1 参与调控生长和形态建成  14-15
      2.2.2 参与苯丙烷类代谢途径的调节  15-16
      2.2.3 与其他蛋白结合共同响应生物或非生物胁迫  16-17
  3 植物抗旱胁迫的研究进展  17-23
    3.1 植物抗旱的形态和生理变化  17-18
    3.2 干旱胁迫下植物膜质氧化作用及保护酶系统的响应  18-19
    3.3 植物抗旱的分子机制  19-22
      3.3.1 信号识别和转导机制  20
      3.3.2 转录调控机制  20-22
    3.4 植物MYB转录因子与干旱胁迫  22-23
  4 本研究的目的和意义  23-24
  5 技术路线  24-25
下篇研究内容  25-51
  1 材料与方法  25-32
    1.1 实验材料、试剂、仪器及引物  25-26
      1.1.1 植物材料  25
      1.1.2 生化试剂  25-26
      1.1.3 引物  26
      1.1.4 主要仪器  26
    1.2 方法  26-32
      1.2.1 MaMYB ORF cDNA的克隆  26-27
      1.2.2 香蕉MaMYB基因的序列分析及系统发育树的构建  27
      1.2.3 香蕉苗干旱处理  27-28
      1.2.4 香蕉苗的盐胁迫处理  28
      1.2.5 香蕉苗的低温处理  28
      1.2.6 香蕉苗的激素处理  28
      1.2.7 香蕉根系总RNA提取及cDNA合成  28
      1.2.8 荧光定量PCR  28-29
      1.2.9 MaMYB基因的亚细胞定位分析  29-30
      1.2.10 拟南芥遗传转化  30-31
      1.2.11 转基因拟南芥根的外部形态分析  31
      1.2.12 MaMYB转基因株系对PEG的敏感度测试  31
      1.2.13 MaMYB转基因植株对干旱胁迫耐受能力的测试  31
      1.2.14 MaMYB转基因拟南芥在干旱胁迫下生理指标的测定  31-32
      1.2.15 野生型和MaMYB转基因拟南芥叶片总RNA的提取及cDNA合成  32
      1.2.16 荧光定量PCR分析各株系胁迫相关基因的表达  32
  2 结果与分析  32-46
    2.1 香蕉MaMYB基因的获得及序列分析  32
    2.2 MaMYB氨基酸序列分析及其结构功能预测  32-34
    2.3 MaMYB基因的亚细胞定位分析  34-36
      2.3.1 植物表达载体.35S::MaMYB-GFP载体的获得  34-35
      2.3.2 MaMYB在洋葱表皮细胞的瞬时表达  35-36
    2.4 MaMYB在不同胁迫处理下的表达含量分析  36-38
      2.4.1 香蕉MaMYB在干旱胁迫下的表达  36
      2.4.2 香蕉MaMYB在盐胁迫下的表达  36-37
      2.4.3 MaMYB在低温胁迫下的表达  37
      2.4.4 MaMYB对ABA胁迫的应答  37
      2.4.5 MaMYB处理下的表达  37-38
      2.4.6 MaMYB在MeJA处理下的表达  38
    2.5 转基因拟南芥的抗旱分析  38-41
      2.5.1 转MaMYB基因的抗性筛选及获得  38
      2.5.2 转基因拟南芥叶片的表型特征  38-40
      2.5.3 野生型和转基因拟南芥的根长特性  40-41
    2.6 转基因株系的抗旱性分析  41-46
      2.6.1 转基因种子对渗透性胁迫的敏感度测试  41-42
      2.6.2 转基因拟南芥株系对脱水胁迫的耐受能力测试  42-43
      2.6.3 WT、VC和转基因拟南芥干旱胁迫下生理代谢分析  43
      2.6.4 野生型和转基因型植株过氧化氢酶的活性鉴定  43-44
      2.6.5 WT、VC和转基因植株过氧化物酶的活性鉴定  44
      2.6.6 转基因植株总超氧化物歧化酶酶活性鉴定  44-45
      2.6.7 干旱胁迫下ABA胁迫应答基因的表达模式  45-46
  3 讨论  46-50
    3.1 MaMYB的生物信息学分析  46-47
    3.2 MaMYB亚细胞定位  47
    3.3 MaMYB差异表达与非生物胁迫的关系  47-48
    3.4 MaMYB基因过表达增强了转基因株系的抗旱性  48-49
    3.5 转MaMYB拟南芥中ABA信号途径相关胁迫基因的表达分析  49-50
  4 结论  50-51
参考文献  51-61
致谢  61

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