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多基因瞬时操纵体系的建立及其在草莓ABA信号产生中的应用研究

作　者: 赵艳侠
导　师: 贾文锁；李冰冰
学　校: 中国农业大学
专　业: 果树学
关键词: 草莓原生质体 FaNCED2 PTPs MAPKs
分类号: S668.4
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)具有广泛的功能,其中ABA与植物抗逆、果实发育及成熟调控的关系国内外的一个研究热点。无论对于抗逆还是果实发育及成熟调控,ABA作用的根本基础在于在特定的条件下ABA水平大幅度提高。因此,ABA信号的产生是操纵ABA功能的根本基础。近年来,虽然国内外围绕ABA的生理功能及其作用机理,也就是ABA信号转导的机理开展了大量研究,以往的研究表明,ABA信号产生可能是多基因协同操纵的,但对ABA信号产生的机理研究较少。对ABA信号产生研究匮乏的原因之一是缺乏高效的基因操纵体系,特别是多基因操纵体系。草莓不仅是重要的果树品种之一,而且日益成为研究果树分子机理的模式材料。近年来的研究表明,ABA在草莓果实发育及成熟调控中起着重要作用。为此,本论文首先建立多基因瞬时操纵体系,在此基础上对ABA信号产生的机理进行了深入研究。主要结果和结论如下：首先以草莓为试材,确定了草莓原生质体游离的优化条件,成功建立了草莓叶片和果实的原生质体游离体系,但是,未能成功建立草莓原生质体多基因转化体系。随后,探索了玉米叶片原生质体的多基因瞬时操纵体系,并证明该体系适用于草莓ABA信号产生研究。分析了草莓的ABA合成关键酶基因FαNCED1、FαNCED2和FαNCED3。克隆NCED2启动子序列,生物信息学分析表明,NCED2启动子序列含有许多响应植物激素、生物和非生物胁迫响应的顺式作用元件。试验证明,外源ABA、甘露醇、蔗糖都能明显的诱导FαNCED2启动子的表达,表明FαNCED2在ABA及逆境应答的ABA信号产生中起着关键作用。基于以前的研究及生物信息学分析,确定了一系列与ABA信号产生相关的信号蛋白。这些信号蛋白从属于三个信号蛋白家族：G蛋白信号蛋白家族、酪氨酸蛋白磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs)家族、促分裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)。本文利用生物信息学的方法筛选得到了草莓G蛋白相关基因,通过半定量分析基因在草莓果实发育不同时期的表达情况,农杆菌瞬时侵染果实未检测到G蛋白相关基因在果实成熟发育中的作用,在草莓中筛选得到了19个PTPs成员以及12个MAPKs。依据FaPTPs家族中DSP1、 DSP3和DSP4,以及FaMAPKs家族中MPK2、MPK4、MPK6和MPK12基因详细的时空表达分析,推定这些信号蛋白与ABA信号产生可能有着密切的关系。利用所建立的原生质体瞬时转化体系,以FαNCED2启动子驱动GUS做报告基因,以CaMV35s强启动子驱动LUC做内参基因,对候选基因在ABA信号产生中的功能进行了深入研究。结果表明,MPK4、MPK6、MPK12的过量表达可以抑制报告基因的表达；相反,DSP1、DSP3、DSP4的过量表达可激活报告基因的表达。有趣的是,DSP1、DSP3和DSP4三个基因中,两个基因及三个基因的共表达极大地促进了报告基因的表达,说明FaPTPs对ABA信号产生的控制存在着协同效应。综合以上结果,本研究揭示了操纵ABA信号产生的六个信号蛋白成员,即DSP1、 DSP3、DSP4, MPK4、MPK6和MPK12。其中,FaPTPs对ABA信号产生的控制存在着协同效应。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
缩略词  9-10
第一章文献综述  10-23
  1.1 ABA信号产生与信号转导途径  10-11
    1.1.1 ABA合成与代谢途径  10
    1.1.2 ABA信号转导途径  10-11
  1.2 植物G蛋白、MAPKs与PTPs蛋白家族  11-15
    1.2.1 植物中G蛋白的结构与功能  11-12
    1.2.2 植物中MAPKs的结构与功能  12-14
    1.2.3 植物PTPs的结构与功能  14-15
    1.2.4 MAPKs与PTPs基因  15
  1.3 植物的遗传转化体系  15-17
    1.3.1 稳定遗传转化  15-16
    1.3.2 瞬时遗传转化  16-17
  1.4 果树原生质体概述  17-22
    1.4.1 原生质体的分离  17-18
    1.4.2 DNA导入的方法  18-20
    1.4.3 报告基因  20-21
    1.4.4 原生质体的应用  21-22
  1.5 研究的目的和意义  22-23
第二章瞬时操纵体系的建立  23-41
  2.1 引言  23
  2.2 材料与方法  23-32
    2.2.1 植物材料  23
    2.2.2 菌株和质粒  23
    2.2.3 主要化学试剂及试剂盒  23-24
    2.2.4 主要溶液配制  24
    2.2.5 试验方法  24-32
  2.3 结果与分析  32-40
    2.3.1 农杆菌介导的多基因瞬时遗传体系  32-35
    2.3.2 叶片和果实的原生质体的游离  35-40
  2.4 讨论  40-41
第三章 ABA信号产生相关信号蛋白的研究  41-77
  3.1 引言  41
  3.2 材料与方法  41-52
    3.2.1 试验材料  41
    3.2.2 主要化学试剂及试剂盒  41-42
    3.2.3 主要溶液配制  42
    3.2.4 试验方法  42-52
  3.3 结果与分析  52-74
    3.3.1 草莓G蛋白家族基因的数据挖掘  52-59
    3.3.2 草莓NCED基因以及NCED2启动子分析  59-62
    3.3.3 草莓ABA信号转导蛋白与FaNCED2的表达调控  62-64
    3.3.4 草莓MAPKs信号蛋白与FaNCED2的表达调控  64-69
    3.3.5 草莓PTPs信号蛋白与FaNCED2的表达调控  69-74
  3.4 讨论  74-77
    3.4.1 草莓G蛋白家族基因与果实发育成熟的关系  74-75
    3.4.2 草莓NCED2的参与ABA和非生物胁迫  75
    3.4.3 草莓MAPKs与PTPs参与ABA信号产生的机制  75-77
第四章结论  77-78
参考文献  78-88
附录  88-92
致谢  92-93
个人简介  93

多基因瞬时操纵体系的建立及其在草莓ABA信号产生中的应用研究

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