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本氏烟中ALY916、Gβ互作蛋白的筛选及其功能的研究

作　者: 刘界文
导　师: 郑小波
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 激发子过敏性细胞死亡酵母双杂交 NbALY916Gβ Rbcs
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物病原菌产生的激发子和病程相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是一类重要的信号分子,模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流,启动不同的级联信号途径,诱发植物的抗病性,导致过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)和气孔关闭。NbALY916是一个调控过敏性细胞死亡的基因,研究发现该基因沉默能抑制Nep1诱导的HR,减缓harpin诱导的HR,且参与MAPKKKa和WRKY2的调控；异三聚体G蛋白连接着细胞表面的受体和下游的效应因子,其中Gp亚基沉默抑制细菌蛋白激发子harpin诱导的过敏反应,Gp亚基包括Gβ1和Gβ2,研究发现它们参与的细胞防卫反应调节途径有所差异。通过对ALY916及Gβ亚基的互作蛋白的筛选,找寻到下游或者上游的调控基因,对完善激发子诱导的防卫反应信号通路途径提供重要依据,可以为有效的病害防控策略提供新的研究思路。本文利用酵母双杂交技术,以ALY916为诱饵蛋白,在烟草cDNA文库中进行靶标筛选,得到一些涉及植物抗逆机制和重要新陈代谢的基因。克隆Nbl-2编码蛋白属于糖原合成酶激酶(GSK)家族蛋白；克隆Nb2-13编码一种过氧化物酶体膜相关蛋白;克隆Nb4-2编码一种醛脱氢酶；克隆Nb7-33编码一类GTP结合蛋白；克隆Nb25-8编码核酮糖二磷酸羧化酶的激活酶前体；克隆Nb12-33编码一个RNA解旋酶；克隆Nb16-3编码一个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase),还有九个克隆比对到的基因功能并未有人进行研究,有待我们探索。分别以G蛋白Gβ1和Gβ2为诱饵蛋白,在烟草cDNA文库筛选其互作蛋白,得到Gβ1和Gβ2的互作蛋白后,选取转化得到重复率较高的基因为对象,构建PVX病毒表达载体,采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)技术筛选能调控受激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡的基因,筛选到能与Gβ1和Gβ2都互作的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(ribulose bisphosphate carboxylase small subunit, Rbcs)基因,该基因沉默后,能抑制harpin诱导的HR, Rbcs沉默后能抑制Nep1、harpin诱导的气孔关闭,harpin诱导的NO积累也受到抑制,该发现对Gp参与的过敏性细胞死亡信号调控途径提供了很好的解释依据。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
上篇文献综述  9-31
  第一章激发子诱发的防卫反应  10-21
    1 激发子的种类  10-12
      1.1 寡糖  10-11
      1.2 糖蛋白  11
      1.3 蛋白类激发子  11-12
    2 激发子信号  12-18
      2.1 PAMP的识别  12-14
      2.2 激发子信号传导  14-16
      2.3 NO和AOS与植物的防卫反应  16-18
    3 调控过敏性死亡的ALY916和Gβ互作蛋白的筛选  18-19
    4 互作筛选的主要方法-酵母双杂交  19-21
  参考文献  21-31
下篇研究内容  31-72
  第一章本氏烟中ALY916互作蛋白的筛选  32-48
    摘要  32
    ABSTRACT  32-34
    1 材料与方法  34-39
      1.1 试剂及培养基  34-35
      1.2 cDNA文库构建  35-37
      1.3 酵母双杂交  37-39
    2 结果与分析  39-41
      2.1 酵母双杂交筛库结果  39-41
      2.2 序列比对及生物信息学分析  41
    3 讨论  41-43
    4 结论  43-45
    参考文献  45-48
  第二章本氏烟中Gβ互作蛋白的筛选及其功能的研究  48-72
    摘要  48
    ABSTRACT  48-50
    1 材料与方法  50-55
      1.1 材料  50-52
      1.2 方法  52-55
    2 结果与分析  55-66
      2.1 酵母双杂交筛库结果  55-57
      2.2 过敏性细胞死亡的调控基因的筛选  57-58
      2.3 互作验证筛库结果  58-59
      2.4 Rbcs沉默效率验证  59-60
      2.5 NbRbcs沉默抑制激发子诱导的气孔关闭  60-61
      2.6 NbRbcs沉默植株削弱激发子harpin诱导的H_2O_2  61-62
      2.7 NbRbcs参与harpin诱导的NO积累  62-63
      2.8 NbRbcs沉默负调控激发子诱导的AOS产生  63
      2.9 与植物防卫、AOS平衡、转录相关的基因转录分析  63-66
    3 讨论  66-69
      3.1 NbRbcs正调控激发子诱发的气孔关闭  66
      3.2 Rbcs参与抗病信号途径  66-67
      3.3 NbRbcs参与harpin诱导的的HCD  67
      3.4 Rbcs参与Gβ的信号调节途径  67-68
      3.5 互作蛋白提供研究Gβ信号途径的基因资源  68-69
    参考文献  69-72
附录  72-78
攻读硕士学位期间发表的研究论文  78-80
致谢  80

本氏烟中ALY916、Gβ互作蛋白的筛选及其功能的研究

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