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与人巨细胞病毒UL23蛋白相作用的宿主蛋白分子筛选与鉴定

作　者: 姚伙旺
导　师: 周天鸿
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: pUL23 人巨细胞病毒酵母双杂交蛋白质相互作用 DNAJB6
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 13次
引　用: 1次
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内容摘要

目的：利用酵母双杂系统来筛选与人巨细胞病毒蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白,并通过GST-pull down和免疫共沉淀技术对蛋白之间的相互作用进行确认,为进一步研究病毒蛋白pUL23的功能奠定基础。方法：1)酵母双杂交试验：以BAC-HCMV TOWNE为模板扩增UL23基因的ORF序列,构建pGBKT7-UL23诱饵质粒,并扩增人胚肾cDNA文库,通过共转化酵母AH109进行酵母双杂交试验,挑选长势良好的克隆100个进行β-半乳糖苷酶活性检测,确定其为阳性克隆,抽提阳性克隆中的文库质粒,电转化至大肠杆菌E.coli DH5α中扩增,PCR文库插入片断,并进行HaeⅢ酶切去重复,然后将含有非重复片段的克隆送进行测序,对测序结果在GenBank上进行同源性搜索和序列比对分析。2)GST-pull down试验：以人胚肾cDNA文库为模板,通过PCR方法扩增人DNAJB6 [DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6(DNAJB6)]基因CDS,插入pGEX4-T-1载体中,IPTG诱导产生GST-DNAJB6融合蛋白；构建pcDNA3.1(-)-HA-UL23质粒,通过Cos-7细胞瞬时表达,进行GST-pull down试验检测pUL23蛋白与人DNAJB6蛋白间的相互作用。3)免疫共沉淀试验：构建pcDNA3.1(+)-HA-DNAJB6和pcDNA3.1(+)-Flag-UL23质粒,共转染Cos-7细胞,采用免疫共沉淀试验进一步验证pUL23蛋白与人DNAJB6蛋白间的相互作用。结果：酵母双杂交试验得到79个阳性克隆,其中一个克隆为人DNAJB6 [DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6 (DNAJB6)]基因。GST-pull down实验和免疫共沉淀试验进一步验证pUL23能与人DNAJB6蛋白相互作用。结论：本课题运用酵母双杂交系统筛选出与HCMV有相互作用的宿主蛋白DNAJB6,并通过GST-pull down和免疫共沉淀试验确认其相互作用,试验结果将为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供线索与依据。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
目录  7-8
一、前言  8-13
  1.1 病毒颗粒结构  8-9
  1.2 病毒基因组结构  9-10
  1.3 病毒感染对宿主细胞的影响  10-12
  1.4 HCMV UL23基因的研究进展  12
  1.5 课题意义  12-13
二、技术路线  13-14
三、实验仪器与材料  14-24
  3.1 主要实验仪器  14-15
  3.2 主要实验材料  15-16
  3.3 主要溶液的配制  16-24
四、实验方法  24-48
  4.1 酵母双杂交筛选试验  24-36
  4.2 GST-pull down验证试验  36-43
  4.3 Co-IP验证试验  43-48
五、结果与分析  48-56
  5.1 酵母双杂交筛选  48-52
  5.2 GST-pull down验证试验  52-54
  5.3 Co-IP验证试验  54-56
六、讨论  56-59
结论  59-60
参考文献  60-68
附录  68-79
致谢  79

与人巨细胞病毒UL23蛋白相作用的宿主蛋白分子筛选与鉴定

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