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柽柳Peroxiredoxin基因（ThPrx1）的克隆及抗逆功能分析

作　者: 蒋丽丽
导　师: 杨传平；王玉成
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 柽柳 Peroxiredoxin 酵母双杂交启动子
分类号: S793.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文从柽柳(Tamarix hispida) cDNA文库中克隆到了一个Prx基因(ThPrx1),该基因是活性氧清除酶类过氧还蛋白(Prx)家族成员。ThPrx1全长为851 bp,开放读码框自165位的ATG起,止于653位的TAA,全长489 bp,共编码162个氨基酸,该蛋白的分子量为17.5KD,理论等电点为6.08。采用Tail-PCP方法扩增出ThPrx1基因的启动子,该启动子的长度为1768 bp。将ThPrx1基因克隆到酵母表达载体pYES2中,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),并用转空pYES2载体的酵母作为对照。分别用NaCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高温、低温、山梨醇、甲基紫精胁迫条件处理转ThPrx1基因酵母与对照(转化空pYES2载体的酵母),试验结果表明：ThPrxl基因对NaCl、KCl、Na2CO3、CuSO4、CdCl2、高温、低温、山梨醇、甲基紫精等胁迫均具有抗性能力。利用SMART技术,构建了以酵母菌株Y187为宿主、用于酵母双杂交柽柳cDNA文库。所获得的文库的插入长度在750 bp到3500 bp之间。转化效率为1.89×107cfu/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.13×107pfu/ml,重组率为80%。将ThPrx1基因构建到酵母双杂交载体(pGBKT7 DNA-BD)中,经毒性和转录自激活检测表明,ThPrxl蛋白无自转录激活能力,其表达蛋白对酵母无毒性,可以用于双杂交分析。用pGBKT7-ThPrx1作为诱饵,筛选了柽柳酵母双杂cDNA文库。用醋酸锂转化法将诱饵和文库质粒转入酵母菌株Y2H,经TDO/X-a-Ga/AbA(Aureobasidin A)培养基筛选得到阳性克隆通过进一步的双杂交筛选验证获得了两个与ThPrx1蛋白互作的蛋白,分别是油体钙蛋白(calcium lipid binding protein)和与CONSTANS互作蛋白(CONSTANS interacting protein)。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-16
  1.1 柽柳简介  8
  1.2 Peroxiredoxin(Prx)的研究状况  8-11
    1.2.1 关于Prx蛋白家族  8-9
    1.2.2 植物中Prx的分类及作用  9-11
    1.2.3 Prx在植物中的功能  11
  1.3 启动子的研究进展  11-13
    1.3.1 启动子的分类  11
    1.3.2 植物启动子的结构  11-12
    1.3.3 启动子克隆的方法  12-13
    1.3.4 启动子克隆的意义  13
  1.4 酵母双杂交的原理及应用  13-15
    1.4.1 酵母双杂交的原理  13-14
    1.4.2 酵母双杂交的组成部分  14
    1.4.3 酵母双杂交的优点  14
    1.4.4 酵母双杂交的缺点  14
    1.4.5 酵母双杂交的应用  14-15
  1.5 研究目的和意义  15-16
2 ThPrx1序列分析及启动子克隆  16-28
  2.1 ThPrx1序列分析  16
  2.2 ThPrx1启动子的克隆  16-19
    2.2.1 材料与试剂  16
    2.2.2 实验方法  16-19
  2.3 结果与分析  19-26
    2.3.1 柽柳ThPrx1基因的生物信息学分析  19-22
    2.3.2 启动子克隆结果分析  22-26
  2.4 讨论  26-27
  2.5 本章小结  27-28
3 ThPrx1基因的酵母转化及抗性分析  28-38
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 菌株与载体  28
    3.1.2 主要化学试剂  28
    3.1.3 培养基  28-29
    3.1.4 主要仪器设备  29
  3.2 方法  29-33
    3.2.1 酵母表达载体pYES2-ThPrx1的构建  29-30
    3.2.2 柽柳ThPrx1基因和醉母表达载体pYES2双酶切  30
    3.2.3 柽柳ThPrx1基因与载体连接  30-31
    3.2.4 酵母表达载体重组质粒pYES2-ThPrx1的鉴定  31
    3.2.5 表达载体pYES2-ThPrx1及空载体pYES2的酵母遗传转化  31
    3.2.6 重组酵母INVSc1(pYES2-ThPrx1)逆境胁迫试验  31-33
  3.3 结果与分析  33-36
    3.3.1 目的基因的PCR扩增及酶切  33
    3.3.2 大肠杆菌重组质粒pYES2-ThPrx1 PCR检测  33-34
    3.3.3 大肠杆菌重组质粒pYES2-ThPrx1双酶切检测  34
    3.3.4 酵母重组质粒pYES2-ThPrx1的PCR检测  34-35
    3.3.5 转Peroxiredoxin基因酵母抗逆性实验  35-36
  3.4 讨论  36-37
  3.5 本章小结  37-38
4 酵母双杂交筛选与ThPrx1相互作用的蛋白  38-57
  4.1 材料  38-39
    4.1.1 植物材料  38
    4.1.2 菌种和载体  38
    4.1.3 试剂和酶  38
    4.1.4 培养基  38-39
  4.2 方法  39-46
    4.2.1 柽柳酵母cDNA文库构建  39-42
    4.2.2 酵母双杂交  42-46
  4.3 结果与分析  46-54
    4.3.1 柽柳总RNA提取  46
    4.3.2 双链cDNA的纯化  46-47
    4.3.3 文库的鉴定  47
    4.3.4 pGBKT7-ThPrx1载体的构建  47-48
    4.3.5 诱饵质粒的自激活及毒性检测  48
    4.3.6 与ThPrx1互作蛋白的筛选  48-49
    4.3.7 阳性克隆的进一步检测  49-53
    4.3.8 阳性克隆酵母质粒的电转及序列信息的获得  53-54
  4.4 讨论  54-55
  4.5 本章小结  55-57
结论  57-58
参考文献  58-64
攻读学位期间发表的学术论文  64-65
致谢  65-66

柽柳Peroxiredoxin基因（ThPrx1）的克隆及抗逆功能分析

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