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梨形马勃胞外多糖发酵培养基组分及提取条件的优化和抗氧化活性研究

作　者: 江华
导　师: 马小魁
学　校: 陕西师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 梨形马勃 液体发酵 胞外多糖 提取工艺 抗氧化活性
分类号: S567.39
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


梨形马勃(Lycoperdon pyriforme Schaeff.:Pers.)属于伞菌亚纲、伞菌目、马勃科(Lycoperdaceae)的大型药用真菌。马勃是一种应用价值广泛、有巨大开发潜力的药用真菌。通过传统的获取子实体及其代谢产物的方式,如野外采集及固体栽培,具有消耗劳动量和时间多而产量低的缺点,不利于该菌的研究开发和推广生产；而利用液体发酵技术进行相关生产,具有不受季节和地域影响,可连续工业化生产,生产规模大、生产周期明显少于野生或人工固体栽培所需时间等优势,因而更具有研究开发价值。目前药用真菌的液体发酵培养已呈现产业化趋势。食药用真菌多糖分离于真菌子实体、发酵液和菌丝体中,在调节细胞生长、增殖、分化和衰老方面具有控制作用,具有十分广泛的生物活性,如抗肿瘤、抗感染、抑制病毒、降低血糖和血脂、抗细胞氧化延迟细胞衰老、激活机体免疫细胞、增强体液免疫和细胞免疫功能等作用,同时由于其对正常细胞没有毒副作用、质量通过化学方式和人工手段容易控制。近年来真菌多糖的提取纯化技术及结构、生物活性等成为国内外临床医学、药理学等领域的研究热点。大多数活性多糖是葡聚糖,其特点是支链具有(1-6)-β-糖苷键而主链具有(1-3)-β-D-糖苷键。马勃多糖作为具有生物活性的多糖,近年来受到人们的关注。本文研究主要分为三个方面,主要包括梨形马勃液体发酵条件优化、发酵液胞外多糖提取工艺条件优化和胞外多糖的抗氧化活性分析。主要结果如下：1.碳源筛选实验结果显示,在7种供试碳源中,葡萄糖作为本次碳源发酵实验产胞外多糖的最佳碳源,其菌丝体干重和胞外多糖的产量分别是9.03g/L、0.82g/L。氮源筛选实验结果显示,以谷氨酸做氮源发酵实验产胞外多糖的最佳氮源,其菌丝体干重和胞外多糖的产量分别是62.49g/L和1.82g/L。不同无机盐对菌丝体生长及多糖含量的影响实验的结果显示,对菌丝体生长及多糖含量的生长具有促进作用的离子种类及浓度为KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O0.1%。在碳源、氮源及无机盐生长因子选择的基础上,进行了液体发酵培养基配比的响应面优化实验,确定了梨形马勃产菌丝量最高时的培养基组成为：麦芽糖7.14%,谷氨酸0.87%,酵母粉0.5%, VB12.81×10-3g/L, KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O0.1%,初始pH值5.5；产胞外多糖最高时的培养基组成为：麦芽糖6.11%,谷氨酸0.70%,酵母粉0.5%, VB12.81×10-3g/L, KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O0.1%,初始pH值5.5。以碳源、氮源、生长因子为影响因素的菌丝体生物量和胞外多糖产量的响应面方程分别如下所示：YCDW=-163.624+31.599X+173.827Y+39.174Z-1.652X2-59.195Y2+1.89Z2-8.6ZXY-1.711XZ-32.078YZYEPS=0.87156+0.08858X-3.60919Y+3.61938Z-0.03512X2+0.66526Y2-1.60012Z2+0.54955XY-0.16320XZ-2.44860YZ式中：YCDW为菌丝体生物量,YEPS为胞外多糖产量,X、Y、Z分别为麦芽糖、谷氨酸、维生素B1。经过响应面方法优化,得到梨形马勃菌液体发酵生产胞外多糖的最优培养条件为(%)：麦芽糖6.11,谷氨酸0.70,VB12.81×10-4,酵母粉0.5, KH2PO40.15, MgSO4·7H2O0.10,初始pH值5.5,恒温震荡摇床转速160r/min以及发酵培养6d。在此条件下进行的验证试验得出的梨形马勃胞外多糖产量平均值为3.71g/L,相比于原始培养条件提高了4.6倍。2.通过单因素分析及响应面优化法研究梨形马勃胞外多糖提取工艺：单因素实验研究了乙醇体积分数、发酵液起始pH值、提取时间等因素对多糖得率的影响为：95%乙醇体积分数,发酵液起始pH8.0,提取时间8.0h。进一步用响应面优化法,以多糖得率为响应值,优化得出的最佳提取条件为：97.35%乙醇体积分数,发酵液起始pH7.42,提取时间13.96h。考虑到实际操作,则取乙醇体积分数97%,发酵液初始pH7.4,提取时间为14h,此条件下预测多糖提取得率可达0.58g,比原单因素实验时的0.40g、0.37g、0.37g分别提高了1.45、1.57和1.57倍。3.比较三氯乙酸法(TCA法)与硫酸铵法脱蛋白的结果表明,二者均不同程度地降低多糖溶液中蛋白质的浓度,去蛋白效果最好的分别为为6%的三氯乙酸和36%的硫酸铵,但三氯乙酸法处理时可能导致多糖结构破坏故多糖损失率较大,因此选择36%硫酸铵法作为最佳除蛋白方法。4.红外光谱分析仪分析粗多糖时显示其在4000～400cm-1区间具有多糖类物质吸收峰及酰胺键(-NH-CO-)和羟基等,存在β构型的单糖连接方式。5.为了找到测定粗多糖抗氧化活性合适的条件,对分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基的进行了一系列条件实验,最终得到的测定抗氧化活性的最佳条件为：177μL的体积加样时,结晶紫体积(2×10-5mol/L):20μL;Fe2+(5×10-3mol/L):18μL;1%H2O2溶液用量为9μL；加入调pH溶液的酸度为4.5；缓冲液体积：136μL,其中Na2HPO4·2H2O(0.2mol/L):61.82μL;柠檬酸C6H8O7·H2O(0.1mol/L):74.18μL,测样稳定时间为加样反应后10min。在测定不同浓度粗多糖样品溶液的抗氧化活性的结果中显示,多糖具有还原能力、清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力,在0.01%～0.5%浓度的多糖溶液中,浓度为1%时多糖溶液的还原力以及清除·OH和·O2-的能力较好,稀释后则0.5%的多糖溶液还原力较强。

全文目录


摘要  3-6
Abstract  6-14
第1章 前言  14-36
  1.1 引言  14
  1.2 马勃的分类地位  14-19
    1.2.1 马勃目Lycoperdales  15-16
    1.2.2 马勃科(Lycoperdaceae)  16-18
    1.2.3 马勃属(Lycoperdon Tourn.:Pers.)  18-19
  1.3 马勃的鉴别性状  19-20
  1.4 马勃的生态分布  20-21
  1.5 马勃的化学成分研究  21-26
    1.5.1 氨基酸  21
    1.5.2 蛋白质和多肽  21-22
    1.5.3 小分子含氮化合物  22-23
    1.5.4 甾体化合物  23-24
    1.5.5 萜类化合物  24
    1.5.6 马勃多糖  24-25
    1.5.7 其他成分  25-26
  1.6 马勃的药理作用  26-29
    1.6.1 抑菌作用  26-27
    1.6.2 止血作用  27
    1.6.3 抗炎、止咳  27-28
    1.6.4 杀虫作用  28
    1.6.5 体外抗细胞分裂(含肿瘤)作用  28-29
  1.7 真菌多糖的研究进展  29-33
    1.7.1 定义  29-30
    1.7.2 真菌多糖的提取与分离纯化  30-32
    1.7.3 真菌多糖的组成、结构分析  32
    1.7.4 真菌多糖的结构分析  32-33
  1.8 立题背景  33-34
  1.9 本文的主要研究内容和意义  34-36
    1.9.1 内容和意义  34-35
    1.9.2 创新之处  35-36
第2章 梨形马勃摇瓶发酵培养基的研究  36-66
  2.1 引言  36
  2.2 实验材料与仪器  36-38
    2.2.1 供试菌种  36
    2.2.2 试剂  36-37
    2.2.3 培养基  37
    2.2.4 实验仪器  37-38
  2.3 实验方法  38-45
    2.3.1 菌种的活化、传代、制备和培养观察  38-39
    2.3.2 梨形马勃菌丝体观察  39
    2.3.3 菌丝体干重(Cell dry weight,CDW)的测定  39-40
    2.3.4 胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)提取  40
    2.3.5 测定胞外多糖  40-41
    2.5.6 发酵液中还原糖的测定  41-42
    2.3.7 pH值测定  42
    2.3.8 梨形马勃液体培养单因素实验研究  42-43
    2.3.9 响应面设计法优化  43-45
    2.3.10 生长曲线的研究  45
  2.4 结果与讨论  45-64
    2.4.1 观察梨形马勃菌种  45-48
    2.4.2 梨形马勃菌的菌丝体和菌丝球观察  48-49
    2.4.4 梨形马勃液体培养单因素实验  49-55
    2.4.5 响应面设计法优化梨形马勃液体发酵培养基  55-63
    2.4.6 梨形马勃的生长曲线  63-64
  2.5 本章小结  64-66
第3章 胞外多糖提取条件的确定  66-76
  3.1 引言  66
  3.2 仪器、材料  66-67
    3.2.1 菌种  66
    3.2.2 试剂  66
    3.2.3 发酵液  66
    3.2.4 仪器  66-67
  3.3 实验方法  67-68
    3.3.1 提取真菌多糖的工艺  67
    3.3.2 提取工艺的单因素实验  67
    3.3.3 响应面法优化多糖提取产率  67-68
  3.4 实验结果与讨论  68-74
    3.4.1 提取时间对多糖提取得率的影响  68
    3.4.2 乙醇体积分数对多糖提取得率的影响  68-69
    3.4.3 发酵液初始pH值对多糖提取得率的影响  69-70
    3.4.4 应用响应面设计法优化梨形马勃胞外多糖提取工艺  70-71
    3.4.5 实验结果及方差分析  71-74
  3.5 本章小结  74-76
第4章 胞外多糖的去蛋白及光谱分析  76-88
  4.1 引言  76
  4.2 材料、仪器  76-77
    4.2.1 材料  76
    4.2.2 试剂  76
    4.2.3 仪器  76-77
  4.3 方法  77-82
    4.3.1 多糖的制备  77
    4.3.2 多糖含量和纯度的统计  77
    4.3.3 杂蛋白的去除  77-78
    4.3.4 蛋白质测定  78
    4.3.5 纯度鉴定  78-80
    4.3.6 红外光谱分析  80-82
  4.4 结果分析与讨论  82-87
    4.4.1 除蛋白方法的选择  82-85
    4.4.2 薄层层析分析  85
    4.4.3 胞外多糖的光谱分析  85-87
  4.5 本章小结  87-88
第5章 体外抗氧化活性的测定  88-102
  5.1 引言  88
  5.2 材料、仪器  88-89
    5.2.1 样品  88
    5.2.2 试剂  88-89
    5.2.3 仪器  89
  5.3 方法  89-92
    5.3.1 抗氧化条件实验——分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基  89-90
    5.3.2 多糖体外抗氧化活性的检测  90-92
  5.4 结果与讨论  92-100
    5.4.1 抗氧化条件实验  92-96
    5.4.2 超氧阴离子自由基(·O~(2-))清除活性的测定  96-97
    5.4.3 总还原能力测定(铁氰化钾还原法)  97-98
    5.4.4 对羟自由基(·OH)的清除活性的测定  98-100
  5.5 本章小结  100-102
总结与展望  102-104
参考文献  104-112
致谢  112-114
攻读学位期间研究成果  114

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