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中国被毛孢液体发酵工艺优化及其多糖制备

作　者: 张曰辉
导　师: 马耀宏
学　校: 齐鲁工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 冬虫夏草中国被毛孢(Hirsutella sinensis) 发酵优化多糖制备
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

冬虫夏草（Cordyceps（Berk）Sacco.）为麦角菌科（Clavicipiraceae）虫草属（Cordyceps），主产于青海、云南、西藏、贵州、四川等海拔3500～5000米山中的草甸土中，作为中药药材的是冬虫夏草菌的子座和它的寄主虫草蝙蝠蛾（Hepialusarmoricanus Oberthur）的长满菌丝体的幼虫体，含有丰富的生理活性物质,为中国特产的名贵中药材。本论文实验出发菌株为中国被毛孢（Hirsutellasinensis）。中国被毛孢被证明为合格发表的冬虫夏草的无性型。由多个单糖或其衍生物聚合而成的是一切生命有机体必不可少的同维持生物机能密切相关的大分子活性化合物为多糖。多糖是非特异性的免疫调节剂，具有抗肿瘤、抗凝血、抗炎、抗病毒、降血脂、降血糖、抗辐射等生物学活性，正逐步成为新药研究开发的重要方向之一[1-2]。本文以中国被毛孢为研究对象，以菌丝干重为目标，对中国被毛孢的发酵条件和培养基进行优化；以中国被毛孢胞外多糖提取量为目标，对中国被毛孢多糖的制备进行优化。在10L小发酵罐上用半合成的培养基进行培养，并将发酵的菌丝体与发酵液分离，然后将菌丝体干燥，将发酵液先浓缩再提取胞外多糖并进行柱前衍生高效液相色谱分析。为了增加中国被毛孢菌丝体的产量，首先进行发酵条件的优化。用PDA再加1.5%蚕蛹粉的半合成的培养基对中国被毛孢进行摇瓶发酵培养，探究出最佳的发酵条件：培养基初始pH6.5，摇瓶装液量为80mL/（250mL），温度18℃，摇床转速150r/min。其次，通过单因素及正交试验对培养基成分进行优化，最终优化出发酵培养基组成：葡萄糖5g/L，玉米粉15g/L，蛋白胨10g/L，蚕蛹粉5g/L，纯牛奶80mL/L，NH₄Cl5g/L，KH₂PO₄0.8g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，核黄素（VB₂）0.8mg/L。采用此培养基在10L发酵罐里培养9d，得到菌丝体干重为14.1g/L，胞外多糖干重为16.47g/L。中国被毛孢菌丝体和多糖产量都得到大幅度的提高。用95%的乙醇对离心浓缩发酵液中的中国被毛孢多糖进行提取，得出用4倍体积的乙醇提取量最高。再将粗多糖脱色、脱蛋白，进行柱前衍生高效液相色谱分析，得出中国被毛孢胞外多糖的单糖组成是葡萄糖、甘露糖、半乳糖。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
第1章绪论  12-24
  1.1 冬虫夏草简介  12
    1.1.1 冬虫夏草真菌的研究历史  12
  1.2 冬虫夏草的生物学特性  12-14
    1.2.1 冬虫夏草的分类与形态  12-13
    1.2.2 冬虫夏草的生活史  13
    1.2.3 冬虫夏草的生长环境  13
    1.2.4 冬虫夏草的无性型的确定  13-14
  1.3 冬虫夏草的化学组成成分  14-15
  1.4 冬虫夏草的药理功能及产品  15-18
    1.4.1 增强机体的免疫调节，激活免疫功能  15-17
      1.4.1.1 促进巨噬细胞的吞噬作用和增加自然杀伤细胞的活性  15-16
      1.4.1.2 增强体液免疫的能力  16
      1.4.1.3 对细胞免疫的能力的影响  16
      1.4.1.4 对细胞因子调节作用的影响  16-17
    1.4.2 抗肿瘤，抑制白血病和癌症的作用  17
    1.4.3 对病原微生物的作用  17
    1.4.4 对抗疲劳，镇静，延长睡眠等的作用  17
    1.4.5 对肾脏和肝脏的作用  17
    1.4.6 对血压血糖的作用  17-18
    1.4.7 对器官移植的作用  18
    1.4.8 冬虫夏草相关产品  18
  1.5 人工培养冬虫夏草  18-19
    1.5.1 冬虫夏草的无性型培养  18-19
    1.5.2 冬虫夏草的有性型培养  19
  1.6 多糖的分离鉴定  19-22
    1.6.1 多糖的提取分离  19-20
      1.6.1.1 多糖的提取  19-20
      1.6.1.2 多糖的除蛋白质  20
      1.6.1.3 多糖中色素的去除方法  20
    1.6.2 多糖的相对分子质量及其分布的测定  20-22
    1.6.3 多糖的酶解  22
  1.7 背景、意义及主要内容  22-24
第2章中国被毛孢培养基条件优化  24-42
  2.1 引言  24
  2.2 实验材料  24-26
    2.2.1 菌种  24-25
    2.2.2 培养基  25
    2.2.3 仪器  25
    2.2.4 试剂  25-26
  2.3 实验方法  26-28
    2.3.0 菌种的接种和保存  26-28
    2.3.1 菌株的摇瓶培养  28
    2.3.2 菌丝干重的测量  28
    2.3.3 pH 的测定  28
    2.3.4 菌丝的观察  28
  2.4 实验结果  28-41
    2.4.1 固体培养基的选择  28-29
    2.4.2 中国被毛孢菌的形态及生长曲线  29-30
    2.4.3 培养条件的优化  30-36
      2.4.3.1 初始 pH 对菌丝体产量的影响  30-32
      2.4.3.2 接种量对就菌丝体产量的影响  32
      2.4.3.3 装液量对菌丝体产量的影响  32-34
      2.4.3.4 温度对菌丝体产量的影响  34-35
      2.4.3.5 转速对菌丝体产量的影响  35-36
    2.4.4 培养基的优化  36-41
      2.4.4.1 碳源种类的选择  36-37
      2.4.4.2 氮源种类的选择  37-38
      2.4.4.3 碳源氮源及培养条件的正交优化  38-39
      2.4.4.4 无机盐及微量元素的优化  39-41
  2.5 本章小结  41-42
第3章中国被毛孢液体深层发酵  42-54
  3.1 引言  42-43
  3.2 实验材料  43
    3.2.1 菌种  43
    3.2.2 培养基  43
    3.2.3 仪器  43
    3.2.4 试剂  43
  3.3 实验方法  43-48
    3.3.1 发酵罐用种子的制备  43-47
    3.3.2 发酵过程中各参数的测定  47
    3.3.3 发酵罐的使用  47-48
    3.3.4 发酵过程中溶氧、温度、pH、液位自动控制策略  48
    3.3.5 还原糖的测定  48
  3.4 实验结果  48-52
    3.4.1 菌体含量及还原糖含量的发酵过程曲线  48-49
    3.4.2 溶氧、转速、通气量的发酵过程曲线  49-50
    3.4.3 发酵过程中通气量及尾气中 O2、CO2的发酵过程曲线  50-52
  3.5 本章小结  52-54
第4章中国被毛孢胞外多糖的提取及分析  54-66
  4.1 引言  54-55
  4.2 实验材料  55-56
    4.2.1 试剂  55-56
    4.2.2 仪器  56
    4.2.3 溶液  56
  4.3 实验方法  56-57
    4.3.1 提取的多糖的称量  56
    4.3.2 多糖提取条件的选择  56-57
      4.3.2.1 乙醇的醇加量的选择  56
      4.3.2.2 醇沉后静置的时间  56
      4.3.2.3 脱色所需的乙醇的温度  56-57
    4.3.3 提取的多糖用柱前衍生高效液相色谱分析  57
      4.3.3.1 多糖的水解  57
      4.3.3.2 柱前衍生化  57
      4.3.3.3 色谱的条件及液体的处理  57
  4.4 实验结果  57-64
    4.4.1 提取条件对多糖提取量的影响  57-59
      4.4.1.1 乙醇醇加量对多糖的提取  57-58
      4.4.1.2 静置时间对多糖提取量的影响  58-59
      4.4.1.3 乙醇温度对脱色的影响  59
    4.4.2 柱前衍生高效液相色谱分析中国被毛孢胞外多糖的结果与分析  59-64
      4.4.2.1 对照品高效液相色谱分析谱图  59-64
  4.5 本章小结  64-66
第五章总结与展望  66-68
  5.1 全文总结  66-67
  5.2 问题及展望  67-68
参考文献  68-74
致谢  74-76
在学期间主要科研成果  76

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