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虫草类中药质量生物评价与控制方法的研究

作　者: 周丹蕾
导　师: 李宝才；肖小河
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 冬虫夏草品质评价质量控制 MTT比色法生物热动力学法
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

中药质量的评价和控制一直是中药现代化研究的难点和热点,现行的“成分论”中药质量评价模式和方法,不仅难以有效地控制中药的质量,更难以反映其有效性和安全性。为寻求解决中药质量评价和控制问题的新突破,本文以品种珍稀,临床常用且物质基础不明确的冬虫夏草为模式药,借鉴生物制剂质量管理模式,探索建立基于生物活性的中药质量评价与控制方法,以补充和完善现行的中药质量评价与控制体系。主要研究结果如下：1.采用RP-HPLC-DAD和RP-HPLC-ELSD法,研究分析了不同样品中13种核苷类成分和2种寡糖类成分含量并分别建立了化学指纹图谱,客观地表征了其化学特征信息的差异性,在此基础上,建立其化学品质模式识别方法,结果表明化学特征信息能较好地区分虫草类中药。2.采用MTT比色法,考察天然虫草和人工虫草体外免疫活性的差异,初步建立MTT比色法的虫草类中药生物活性检测方法,考察不同供试品对刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响,并对实验结果进行聚类分析。结果表明,虫草在0.36～11.52 mg/ml浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞无毒性,高浓度(>0.72 mg/ml)时对淋巴细胞的增殖作用明显(P<0.05)3.采用生物热动力学法,考察天然虫草和人工虫草对大肠杆菌生长代谢的影响。初步建立了基于生物热动力学法的检测方法。以指数生长期最大发热功率(P1max)和有效率(E)为指标,客观地表征天然虫草和人工虫草对大肠杆菌生长代谢的影响,并对实验结果进行聚类分析。结果显示,天然虫草和人工虫草有促进大肠杆菌生长、调节胃肠道微生态平衡的作用。与空白对照相比,当虫草浓度>6.0 mg/ml时,天然虫草对大肠杆菌生长代谢促进作用显著(P<0.05)且与浓度间的量效关系良好(r>0.9),人工虫草的促菌作用不显著(P>0.05)且与浓度无明显的量效关系(r<0.6),当虫草浓度<6.0 mg/ml,促菌作用均不显著(P>0.05)。结果经聚类分析,两者可较好地区分,提示微量量热法可用于评价天然虫草和人工虫草的质量,在中药品质评价方面具有一定的应用潜力。4.综合分析试验结果的关联性,分别进行了化学组分信息-生物活性信息、生物活性信息-生物活性信息的相关性分析,结果显示：某些指标性成分与生物活性信息表达之间存在较为显著的正相关关系；MTT比色法所得实验结果与生物热动力学信息之间具有良好的相关性和一致性(相关系数r>0.9,P<0.01),提示两种生物效价检测方法可作为现行化学指标成分评价方法的补充和完善,可用于对虫草类中药品质的评价和控制。5.综合分析不同评价方法,分别进行了化学分析与生物评价方法的比较、不同生物效价检测方法的比较。结果显示：生物评价方法可应用于虫草类中药品质评价,是对其化学分析的方法的补充和完善；生物热动力学法和MTT比色法均可用于评价虫草质量。初步构建了冬虫夏草品质生物评价和控制方法,从药典常规、化学组分、生物活性等方面对中药品质评价进行把关,其中生物活性检测方法是其品质评价的核心内容。上述研究结果表明,所建立的中药品质生物评价方法已初步显示出在冬虫夏草品质评价中的作用和价值,该方法为其他药效物质不明确的补益类中药质量控制和评价提供了新的思路和技术参考。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章绪论  14-23
  1.1 中药质量控制模式和方法的现状与出路  14-17
    1.1.1 中药质量评价与控制的现状  14-15
    1.1.2 现行中药质量控制方法和标准的局限性  15
    1.1.3 中药、化学药和生物制品质量控制模式的比较分析  15-16
    1.1.4 生物效价检测方法及其在中药质量评价中的应用和意义  16-17
  1.2 中药质量评价与控制的关键技术问题  17-18
    1.2.1 生物效价检测方法的筛选与验证  17-18
    1.2.2 生物效价检测用参照物的选取与标定  18
  1.3 本课题的总体研究思路  18-23
    1.3.1 本课题的研究目标  18
    1.3.2 以冬虫夏草为模式药进行质量控制的依据和意义  18-19
    1.3.3 本课题的研究内容和技术路线  19-20
    1.3.4 示范品种冬虫夏草的化学、药理研究和质量控制现状  20-23
第二章样品采集加工和化学分析  23-39
  2.1 样品的采集  23-24
  2.2 样品的前处理和制备  24-25
    2.2.1 样品的前处理  24
    2.2.2 样品的制备  24-25
  2.3 样品的化学分析  25-37
    2.3.1 供试品中核苷类成分含量测定  25-29
    2.3.2 供试品的化学指纹图谱分析  29-31
    2.3.3 供试品中寡糖类成分含量测定  31-34
    2.3.4 供试品的化学指纹图谱分析  34-37
  2.4 小结  37-39
第三章基于生物热力学的虫草类样品质量控制方法的研究  39-58
  3.1 生物热动力学分析的方法学研究  39-46
    3.1.1 生物热动力学方法与微量量热仪简介  39-41
    3.1.2 生物热动力学分析条件的优化  41-45
    3.1.3 生物热动力学分析的方法学考察  45-46
  3.2 生物热动力学表达的虫草类中药对大肠杆菌代谢调节的研究  46-50
    3.2.1 材料与仪器  46
    3.2.2 供试品的制备  46
    3.2.3 大肠杆菌生长代谢热谱曲线图的测定  46-47
    3.2.4 实验结果  47-49
    3.2.5 讨论  49-50
  3.3 生物热动力学表达的虫草类中药对大鼠免疫活性调节的研究  50-57
    3.3.1 材料与仪器  50-51
    3.3.2 供试品的制备  51
    3.3.3 大鼠线粒体的提取  51
    3.3.4 大鼠线粒体生长代谢热谱曲线图的测定  51
    3.3.5 结果  51-57
  3.4 小结  57-58
第四章基于MTT比色法的中药体外免疫活性的研究  58-63
  4.1 阳性对照的选择  58
    4.1.1.MTT比色法概述  58
    4.1.2.阳性对照药的选择  58
  4.2 不同样品的体外免疫活性评价  58-63
    4.2.1 实验材料  58-59
    4.2.2 实验方法  59-60
    4.2.3 结果与分析  60-62
    4.2.4 讨论  62-63
第五章综合分析  63-72
  5.1 实验结果的相关性分析  63-64
    5.1.1.虫草类中药生物活性与化学信息的相关性分析  63-64
    5.1.2 不同方法所测虫草类中药生物活性的相关性分析  64
  5.2 虫草类中药品质评价方法的比较研究  64-66
    5.2.1 化学分析与生物评价方法的比较分析  64-65
    5.2.2 生物热动力学与MTT比色法分析特点的比较研究  65-66
  5.3 虫草类中药品质的模式识别  66-69
    5.3.1 基于指纹图谱相似度分析的虫草类中药品质的模式识别  67
    5.3.2 基于生物效应信息的虫草类中药品质的模式识别  67-69
  5.4 虫草类中药品质评价方法的初步构建  69-72
第六章结语与讨论  72-76
  6.1 主要研究结果和结论  72-73
  6.2 问题与建议  73-76
致谢  76-77
参考文献  77-81
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  81

虫草类中药质量生物评价与控制方法的研究

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