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紫苏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及序列分析

作　者: 孙雪梅
导　师: 吕晓玲
学　校: 天津科技大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 紫苏 苯丙氨酸解氨酶 基因克隆 序列分析
分类号: S567.219
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 16次
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内容摘要


本研究以紫苏嫩叶cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术,首次从紫苏中克隆到迷迭香酸生物合成途径上的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)基因(命名为Per PAL)全长cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析和表达谱研究。通过对已报道的唇形科植物丹参、藿香等的PAL基因保守序列进行比对,设计引物,采用RACE的方法克隆到2458bp的cDNA全长,包含2136bp的开放阅读框(ORF),编码712个氨基酸,96bp的5’非编码区(5’UTR)和226bp的3’非编码区(3’UTR)。 BLAST比对显示该基因与已报道的PAL基因具有很高的相似性,其核苷酸序列与丹参的相似度达90%,与藿香、黄芪的分别达85%和82%,氨基酸序列与丹参、藿香的相似度为88.69%,说明已成功克隆到PerPAL基因。用生物信息学软件对所克隆的紫苏PerPAL基因进行序列分析,结果表明：其编码的氨基酸的亲水性分析表现为亲水性；信号肽研究结果表明其不存在信号肽酶切位点,不具有信号肽。同时,跨膜结构域预测结果显示其不具有跨膜结构域。对紫苏PAL蛋白前体的二级结构预测显示,其含有45.57%的α螺旋、11.11%的延伸链和43.32%的随机卷曲；进一步对其高级结构进行预测,得到了PerPAL蛋白的三维模型。PAL系统进化树分析结果表明,各PAL编码的蛋白均有明显的种属特性,PerPAL与唇形科植物的PAL亲缘关系最近,且PAL基因早在被子植物和裸子植物中就已经存在,是一个古老的基因。以紫苏β-Actin基因作内标,采用RT-PCR法分析PerPAL-1基因在根、茎、叶的相对表达量,结果表明PerPAL-1基因在叶中的表达丰度最高,茎中最低,推断PAL在紫苏各组织中的表达可能与迷迭香酸的合成成正相关。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-26
  1.1 紫苏  8-11
    1.1.1 概述  8
    1.1.2 分布  8
    1.1.3 成分  8-9
    1.1.4 紫苏的生物活性  9-11
  1.2 迷迭香酸  11-17
    1.2.1 结构  11
    1.2.2 分布  11-12
    1.2.3 迷迭香酸的生物活性  12-15
    1.2.4 迷迭香酸的合成  15-17
  1.3 PAL  17-22
    1.3.1 PAL的存在与分布  18-19
    1.3.2 PAL酶学性质  19
    1.3.3 PAL的植物生理学作用  19-20
    1.3.4 PAL基因的克隆与表达  20-21
    1.3.5 PAL的研究展望  21-22
  1.4 RACE技术  22-24
    1.4.1 RACE的原理  22-23
    1.4.2 RACE的局限性  23
    1.4.3 RACE的技术改进  23-24
    1.4.4 RACE技术在植物基因研究中的应用  24
    1.4.5 RACE在植物基因研究上的发展前景  24
  1.5 本课题的研究目的及意义  24-25
  1.6 本论文研究的内容  25-26
2 材料与方法  26-39
  2.1 材料  26
  2.2 主要试剂  26-27
  2.3 主要仪器设备  27
  2.4 实验方法  27-39
    2.4.1 紫苏真叶总RNA的提取及检测  27-28
    2.4.2 cDNA第一链合成  28
    2.4.3 同源序列比对及中间片段引物的设计合成  28-30
    2.4.4 紫苏目的基因片段的克隆  30-32
    2.4.5 目的基因片段的测序  32
    2.4.6 紫苏PAL基因5'端cDNA的克隆  32-34
    2.4.7 紫苏PAL基因3'端cDNA的克隆  34-37
    2.4.8 目的基因的生物信息学分析  37
    2.4.9 PerPAL-1基因的组织表达谱研究  37-39
3 结果与讨论  39-56
  3.1 紫苏真叶中总RNA的提取  39
  3.2 PAL基因片段的克隆  39-42
    3.2.1 PerPAL-1的克隆  39-40
    3.2.2 PerPAL-2的克隆  40-41
    3.2.4 PerPAL-3的克隆  41-42
    3.2.5 PerPAL-4的克隆  42
  3.3 片段测序结果及拼接  42-43
  3.4 PerPAL 5’端及3’端cDNA的克隆  43-44
    3.4.1 PerPAL 5’端cDNA的克隆  43-44
    3.4.2 PerPAL 3’端cDNA的克隆  44
  3.5 PerPAL基因序列全长  44-49
  3.6 紫苏PAL的生物信息学分析  49-52
    3.6.1 PerPAL疏水性分析  49
    3.6.2 PerPAL二维结构模型分析  49-50
    3.6.3 PerPAL信号肽分析  50-51
    3.6.4 PerPAL跨膜结构域分析  51-52
    3.6.5 PerPAL三维结构模型  52
  3.7 PerPAL进化树分析  52-53
  3.8 PerPAL-1基因的组织表达谱分析  53-56
    3.8.1 β-Actin PCR反应条件的优化  53-54
    3.8.2 PerPAL-1基因在根、茎、叶中相对表达量分析  54-56
4 结论  56-57
5 展望  57-58
6 参考文献  58-65
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  65-66
8 致谢  66-67
附录  67-68

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