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猕猴桃溃疡病相关细菌的鉴定及致病性研究

作　者: 李莎莎
导　师: 檀根甲
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 猕猴桃溃疡病 分离 表型鉴定 分子特征 致病性 荧光假单胞菌
分类号: S436.634
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猕猴桃溃疡病是一种世界性的侵染猕猴桃的细菌性病害，该病害危害极大，严重时可致使全园毁灭，造成严重的经济损失。该病害在中国、日本、韩国、意大利、新西兰等主要猕猴桃种植国家均有发生。目前猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃产区的发生呈上升趋势，个别年份甚至大流行。由于我国对猕猴桃溃疡病的病原缺乏系统的研究，因此，本研究分别在安徽、陕西、重庆等地猕猴桃果园重病区采集病样，对该病害的相关细菌进行了分离，并对其做了表型鉴定、分子特征分析以及致病性测定等研究。主要研究结果如下：1．猕猴桃溃疡病相关细菌的分离及表型鉴定本研究采用研磨稀释分离法分别用三种培养基对采集的病样进行分离，共得到328株出现频率高并具有代表性的菌株，这些菌落在BPA培养基上培养的形态有三类：一类是菌落呈白色，圆形隆起，边缘呈光滑的波浪状，共311株。其中有282株革兰氏染色为阴性，能动，好氧，LOPAT试验为（++–++），七叶苷水解和明胶液化试验为阳性，能利用葡萄糖产酸，能利用葡萄糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，乳糖，麦芽糖，并且能在KB培养基上产荧光色素，初步鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。另29株革兰氏染色为阴性，兼性厌氧，能动，LOPAT试验为（+–––+），产荧光色素试验、明胶液化试验均为阴性，过氧化氢酶反应和七叶苷水解试验为阳性。第二类是菌落黄色，圆形光滑，全缘。第三类是菌落初呈乳白色，后产生黄色素，菌落生长快。2．猕猴桃溃疡病相关细菌的分子特征分析利用丁香假单胞猕猴桃致病变种的特异性引物PsaF1/R2、PsaF3/R4，对125株细菌的全基因组DNAITS区域进行双重PCR扩增，凝胶电泳检测结果表明仅意大利提供的P. syringae pv. actinidiae菌株F285、Fc84、F28c在175bp和280bp左右的位置检测到两条扩增片段，分离所得细菌均未检测到目的片段。利用细菌16S rRNA片段通用引物P1F/P2R，对125株细菌全基因组DNA做PCR扩增，均得到一条大小约为1500bp目的片段，分别用限制性内切酶HaeIII和MSPI对16S rRNA-PCR扩增片段酶切，酶切图谱显示，内切酶HaeIII将菌株分为四类，MSPI将菌株分为五类，酶切结果与菌株的表型鉴定结果大体一致。选取14株代表性细菌，将其16S rRNA-PCR扩增片段进行T/A克隆、序列测定，对获得序列在NCBI数据库中进行Blast搜索，结果显示意大利提供的P. syringae pv. actinidiae菌株F285、Fc84、F28c的16S rRNA片段与P. s. pv. actinidiae同源性达99%，菌株AHK-1、AHK-2、A1-3、A2-1、A2-2与P. fluorescens同源性达99%，菌株A17、F-7与Rahnella spp.同源性达99%，菌株C101、AL-3与Xanthomona spp.同源性达99%，菌株B-2、C-3与Pantoea agglomerans同源性达99%。采用假单胞菌属ITS间隔区通用引物D21/D22，对14个代表性细菌全基因组DNA进行PCR扩增结果表明： P. s. pv. actinidiae和P. fluorescens在600bp左右的位置检验出单一条带，与预期结果一致。Rahnella spp.，Xanthomona spp.和Pantoeaagglomerans进行ITS序列的PCR扩增未检测到目标片段。将假单胞属细菌ITS区域扩增片段进行T/A克隆测序，在NCBI数据库中进行比对，结果显示AHK-1,AHK-5A1-3，A2-1，A2-2菌株的rRNA-ITS序列与P. fluorescens菌株A506,62e和2313的同源性高达97%～99%，菌株F285、 Fc84、F28c的rRNA-ITS序列与P. s. pv.actinidiae菌株PA835和Kw-11的同源性为99%。对获得序列与已知细菌的ITS序列进行聚类分析，结果显示P. fluorescens和P. syringae， P. avellanae属不同的分支（89%bootstrap support），而本实验分离所得的Pseudomonas菌株与P. fluorescens紧密相邻（95%bootstrap support），意大利提供的P. s. pv. actinidiae菌株与P. s. pv.actinidiae相近（63%bootstrap level）。3．猕猴桃溃疡病相关细菌的致病性测定将14个代表性细菌菌株制成107～108CFU/mL菌悬液，分别接种烟草叶片、离体健康猕猴桃植株的1～2年生枝条、嫩梢以及活体猕猴桃植株的嫩梢和叶片。观察发现，除Pantoea agglomerans引起的烟草叶片过敏性反应较弱，其它菌株包括Rahnella spp.，Xanthomonas spp.，P.fluorescens和P. s. pv. actinidiae均能引起烟草叶片产生过敏性枯斑；但是仅只有P.fluorescens和P. s. pv. actinidiae菌株能引起猕猴桃枝条、嫩梢以及叶片发病，其他菌株与无菌水对照接种部位无明显发病症状，通过柯赫氏法则验证，从发病的组织上成功分离到P. fluorescens和P. s. pv. actinidiae菌株。因此，我们认为P. fluorescens是猕猴桃细菌性溃疡病的致病因子之一。迄今为止，P. fluorescens作为一种新的猕猴桃溃疡病的致病因子在中国尚属首次报道。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-13
1 文献综述  13-21
  1.1 猕猴桃细菌性溃疡病病害症状及危害  13-14
    1.1.1 猕猴桃细菌性溃疡病病害症状  13-14
    1.1.2 危害  14
  1.2 发病特点  14-17
    1.2.1 病情调查  14-15
    1.2.2 发病特点  15-17
  1.3 病原菌  17-19
    1.3.1 病原菌分类  17-18
    1.3.2 生物学特性  18
    1.3.3 病原菌侵染循环  18-19
  1.4 综合防治  19-20
    1.4.1 植物检疫  19
    1.4.2 农业防治  19
    1.4.3 化学防治  19
    1.4.4 生物防治  19-20
  1.5 存在问题及展望  20-21
2 引言  21-23
3 材料与方法  23-34
  3.1 猕猴桃溃疡病病样的采集与分离  23
    3.1.1 病样采集  23
    3.1.2 培养基  23
    3.1.3 分离保存  23
  3.2 菌株的形态学及生理生化特性分析  23-26
    3.2.1 培养基  23-24
    3.2.2 供试菌株  24
    3.2.3 试验方法  24-26
  3.3 猕猴桃溃疡病病相关细菌的分子鉴定  26-32
    3.3.1 试验所用的培养基、试剂及仪器  26-27
    3.3.2 供试菌株  27-28
    3.3.3 模板 DNA 的制备  28
    3.3.4 供试菌株双重 PCR 特异性检测  28-29
    3.3.5 供试菌株 16S rRNA 片段的序列分析  29-32
    3.3.6 代表性细菌 16S-23S rRNA 转录间隔区序列分析  32
  3.4 代表性细菌的致病性测定  32-34
    3.4.1 供试菌株  32-33
    3.4.2 供试材料  33
    3.4.3 试验方法  33-34
4 结果与分析  34-48
  4.1 分离及特征记录  34-36
  4.2 猕猴桃溃疡病相关细菌的分子鉴定及序列分析  36-43
    4.2.1 供试菌株双重 PCR 特异性检测  36-37
    4.2.2 供试菌株 16S rRNA 片段序列分析  37-40
    4.2.3 代表性细菌 16 S-23 S rRNA 转录间隔区序列分析  40-43
  4.3 代表性细菌的致病性测定  43-48
    4.3.1 烟草叶片的过敏性反应  43-44
    4.3.2 离体枝条和嫩梢上的致病性测定  44-45
    4.3.3 活体嫩梢和叶片上的致病性测定  45-48
5 讨论  48-51
  5.1 猕猴桃溃疡病病样采集与相关细菌的分离  48
  5.2 猕猴桃溃疡病相关细菌的生理生化特性  48
  5.3 猕猴桃溃疡病相关细菌的分子鉴定  48-49
  5.4 猕猴桃溃疡病相关细菌的致病性测定  49-51
6 结论  51-54
  6.1 猕猴桃溃疡病相关细菌分离及表型分析  51
  6.2 猕猴桃溃疡病相关细菌的分子特征  51-52
    6.2.1 相关细菌的双重 PCR 特异性检测  51
    6.2.2 相关细菌的 16S rRNA 片段序列分析  51-52
    6.2.3 代表性细菌的 ITS 区域序列分析  52
  6.3 代表性细菌的致病性测定  52-54
    6.3.1 烟草叶片的过敏性反应  52-53
    6.3.2 离体猕猴桃枝条和嫩梢上的致病性测定  53
    6.3.3 活体猕猴桃嫩梢和叶片上的致病性测定  53-54
参考文献  54-60
致谢  60-61
作者简介  61
[附]攻读硕士学位期间已发表的学术论文  61

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 浆果类病虫害 > 猕猴桃病虫害
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