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猕猴桃溃疡病菌的分子检测研究

作　者: 刘瑶
导　师: 朱天辉
学　校: 四川农业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 猕猴桃溃疡病 丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种 RAPD SCAR
分类号: S436.634
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猕猴桃溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性细菌病害,严重制约我国乃至世界范围内猕猴桃种植产业发展。该病已被列为林业检疫性有害生物,因此加大对该病的检疫力度势在必行。由于该病存在潜伏侵染现象,为尽早诊断出病害,必须建立能够在病害发生早期快速诊断病害的方法。本研究利用RAPD技术从猕猴桃溃疡病菌及其相似菌株中筛选出致病菌的特异片段,在对特异片段克隆测序的基础上,设计特异引物将不稳定的RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记,优化特异引物扩增条件,以此达到分子快速检测猕猴桃溃疡病的目的。本研究取得如下结果：1.利用单因素变量分析法从模板浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs用量、引物用量以及退火温度等六方面优化猕猴桃溃疡病菌的RAPD-PCR扩增条件。其优化结果为：25μL反应总体积包含模板DNA(100ng/μL)lμL引物(12.5μmol/L)1μL; dNTPs (10mmol/L)2μL; Mg2+(25mmol/L)2μL; TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL;10×Buffer2.5μL；ddH2O16.3μL;最适反应程序：95℃预变性5min；94℃变性60s,36℃退火60s,72℃延伸120s,共40个循环；最后一循环后72℃延伸10min,最后4℃保存。2.利用RAPD技术从120条随机引物中筛选出可从众多参试菌株中检测出猕猴桃溃疡病菌的特异引物P7(5’-CGCAGCCGAGAT-3’),并获得一条1300bp左右的猕猴桃溃疡病菌的特异片段。3.在对特异片段克隆测序的基础上,设计一对特异引物F7/R7(F7:5’-CGATTCGCAGCCGAGATG-3’; R7:5’-CTACGAGGTTAGGTTCAGAGT-3’)成功地将不稳定的RAPD标记转化为SCAR标记。优化特异引物扩增条件,获得最适反应体系和退火温度：25μL反应体系含12.5μL Premix Taq;1μL引物F7(10μmol/L);1μL引物R7(10μmol/L);2.5μL模板DNA (40ng/μL); ddH2O补足至25μL；最适退火温度为56℃。该特异引物经检测显示,对猕猴桃溃疡病菌具有较强的特异性,可以检测DNA浓度为100fg/μL的病原菌。4.将SCAR标记特异引物用于实际病害检测,不仅可以检测出接种病原菌的猕猴桃枝条组织中的致病菌,还可以检出自然感病状态下枝条组织中的病原菌。同时,不论染病枝条显症与否,利用SCAR特异引物均能检出病原菌。此外,将SCAR特异引物与四对国外已发表的引物进行对比,发现针对四川地区的猕猴桃溃疡病菌,本研究获得的特异引物更具特异性,而其他四对引物则不具备检测该病的特异性。总之,利用优化后的RAPD-PCR扩增可以筛选出猕猴桃溃疡病菌的特异片段,根据特异片段序列可设计获得SCAR特异引物。利用特异引物,参考优化后的扩增条件,结合简单的试剂盒法提取基因组DNA,可在短时间内检测出处于不同发病阶段的猕猴桃组织中的病原菌,以此达到诊断病害的目的。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
符号说明  9-10
目录  10-13
前言  13-14
1 文献综述  14-25
  1.1 猕猴桃溃疡病研究现状  14-17
    1.1.1 病害分布及症状危害  14
    1.1.2 病原菌研究  14-15
    1.1.3 病害发生规律  15-16
    1.1.4 病害综合防治  16-17
  1.2 细菌分类鉴定研究现状  17-18
  1.3 传统病原细菌检测技术  18-21
    1.3.1 表观症状检测  19
    1.3.2 分离培养检验  19-20
    1.3.3 染色检验  20-21
    1.3.4 洗涤检验  21
  1.4 现代生物技术及分子生物学技术在病原菌检测鉴定上的应用  21-24
    1.4.1 免疫诊断技术  21-22
    1.4.2 分子杂交技术  22-23
    1.4.3 分子标记技术  23-24
  1.5 猕猴桃溃疡病菌分子检测研究现状  24-25
2 研究目的及意义  25-26
3 研究内容与技术路线  26-27
  3.1 研究内容  26
    3.1.1 猕猴桃溃疡病菌的RAPD分析  26
    3.1.2 猕猴桃溃疡病菌SCAR分子标记研究  26
    3.1.3 猕猴桃溃疡病的分子检测  26
  3.2 技术路线  26-27
4 研究材料与方法  27-33
  4.1 研究材料  27-28
    4.1.1 供试菌株及培养条件  27
    4.1.2 猕猴桃枝条  27
    4.1.3 培养基  27-28
    4.1.4 实验试剂  28
    4.1.5 实验设备  28
  4.2 研究方法  28-33
    4.2.1 基因组DNA提取  28-29
    4.2.2 猕猴桃溃疡病菌的RAPD分析  29-31
    4.2.3 猕猴桃溃疡病菌SCAR分子标记研究  31-32
    4.2.4 猕猴桃溃疡病菌的分子检测  32-33
5 结果与分析  33-47
  5.1 供试材料基因组DNA提取结果  33-34
  5.2 猕猴桃溃疡病菌RAPD分析  34-42
    5.2.1 RAPD扩增条件优化  34-38
    5.2.2 RAPD扩增分析  38-42
  5.3 猕猴桃溃疡病菌SCAR标记转化  42-46
    5.3.1 RAPD特异片段克隆  42-43
    5.3.2 特异片段序列  43
    5.3.3 SCAR特异引物设计  43-44
    5.3.4 特异引物PCR扩增条件优化  44-45
    5.3.5 特异引物特异性验证  45
    5.3.6 特异引物灵敏度验证  45-46
  5.4 猕猴桃溃疡病菌的分子检测  46-47
    5.4.1 猕猴桃枝条组织溃疡病菌检测  46
    5.4.2 已发表引物对溃疡病菌检测结果  46-47
6 结论与讨论  47-52
  6.1 基因组DNA提取  47-48
  6.2 RAPD扩增条件优化  48-49
  6.3 猕猴桃溃疡病菌的RAPD检测  49-50
  6.4 猕猴桃溃疡病菌SCAR标记转化  50-51
  6.5 猕猴桃溃疡病菌的分子检测  51-52
  6.6 结论  52
7 实验创新点及展望  52-54
参考文献  54-61
致谢  61-62
攻读学位期间发表的学术论文目录  62

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 浆果类病虫害 > 猕猴桃病虫害
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