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苹果轮纹病菌对戊唑醇抗性的遗传稳定性研究

作　者: 贾广成
导　师: 朱建兰
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 苹果轮纹病菌戊唑醇吸光值 ITS（Internal Transcribed Spacer） EF-1α基因 β-tubulin基因
分类号: S436.611.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苹果轮纹病(Botryosphaeria dothidea)是苹果上的重要病害，化学防治仍占主导地位，抗药性的产生值得关注。本研究通过测定戊唑醇、紫外线、电磁波和水杨酸处理对苹果轮纹病菌不同菌株抗药性的变化，研究苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性规律；通过对微管蛋白和转录因子基因的研究，为苹果轮纹病菌的致病机理提供理论基础；将传统的研究方法和分子生物学结合，研究苹果轮纹病的敏感性差异，系统发育树的构建，明确苹果轮纹病菌对戊唑醇抗性的遗传分化。结果如下：1采用生长速率法测定供试苹果轮纹病菌和不同诱导处理后的不同菌株对戊唑醇的敏感性。结果表明，不同苹果轮纹病菌株对戊唑醇的敏感性不同，同一菌株经过不同处理后对戊唑醇的敏感性也有差异。连续使用戊唑醇使苹果轮纹病菌株大部分产生抗药性，使用量的加大会使抗药性加强；紫外线处理对苹果轮纹病菌抗药性有明显的影响，但不同处理的作用强度明显不同，菌种抗性变化和处理时间不成正相关；电磁波处理对苹果轮纹病菌的抗药性也有明显的影响，菌种抗性变化和处理时间不成正相关；水杨酸处理对苹果轮纹病菌的抗药性亦有明显的影响，但不同浓度处理的作用强度有明显差异，0.01mg/L，0.1mg/L和1mg/L的水杨酸对菌株产生不同影响。2通过田间试验测定诱导处理菌株对苹果枝条的致病力。结果表明，不同处理，不同菌株致病力有明显差异，其中致病力最强的菌株是700MHz电磁波处理40秒的来自于山东海阳的YT1菌株，其接种在苹果枝条上的病情指数为70.37；致病力最弱的菌株是253.7nm处理5分钟的来自于山东栖霞的YT1和0.1mg/L戊唑醇培养基上培养八代的来自河南郑州的ZZ42菌株，其接种在苹果枝条上的病情指数都为13.58；这表明不同处理的不同菌株的致病力不同。病情指数存在显著性差异。3在350nm、650nm和950nm的波长下测原始菌株和处理后菌株代谢液的吸光值。结果表明，不同处理造成菌株在代谢液的吸光值上有明显差异。4采用CTAB法提取菌株的总量DNA，利用引物ITS1和ITS4扩增ITS片段，采用引物728F和986R扩增EF-1α基因片段，利用引物Bt2a和Bt2b扩增β-tubulin片段。表明，苹果轮纹菌rDNA的ITS基因与B.dothidea的ITS基因序列相似性高达99%，苹果轮纹菌rDNA的EFα-1基因与B.dothidea的EF-1α基因序列相似性高达98%，苹果轮纹菌rDNA的β-tubulin基因与B.dothidea的β-tubulin基因序列相似性高达99%。构建苹果轮纹菌与其它近缘菌ITS基因，EF-1α基因和β-tubulin基因的系统发育树，发现苹果轮纹菌与B.dothidea单独成一个分支，这说明B.dothidea能够导致苹果轮纹病的发生。对处理前后同一菌株的ITS基因进行测序对比，发现ITS的序列发生了的变化。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-8
第一章文献综述  8-16
  1.1 苹果生产情况  8-9
  1.2 苹果轮纹病的研究概况  9-13
    1.2.1 葡萄座腔菌属  9
    1.2.2 苹果轮纹病的发生和危害  9-10
    1.2.3 苹果轮纹病菌的病原学研究  10-11
    1.2.4 苹果轮纹病菌的分子生物学研究  11-13
  1.3 研究目的和意义  13-14
  1.4 主要内容和技术路线图  14-16
    1.4.1 主要研究内容  14-15
    1.4.2 技术路线  15-16
第二章不同诱导因子处理苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性的影响  16-28
  2.1 材料和方法  16-19
    2.1.1 材料  16-17
    2.1.2 方法  17-19
  2.2 结果与分析  19-27
    2.2.1 苹果轮纹病菌对戊唑醇的抗药性  19-21
    2.2.2 戊唑醇对苹果轮纹病菌抗药性的影响  21-23
    2.2.3 紫外线处理苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性的影响  23-24
    2.2.4 电磁波处理苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性的影响  24-25
    2.2.5 水杨酸处理苹果轮纹病菌对戊唑醇抗药性的影响  25-27
  2.3 结论与讨论  27-28
第三章不同处理对苹果轮纹病菌菌株田间致病力的影响  28-33
  3.1 材料与方法  28-29
    3.1.1 供试菌种  28
    3.1.2 接种材料  28
    3.1.3 接种方法  28-29
  3.2 结果与分析  29-31
  3.3 结论与讨论  31-33
第四章不同处理对苹果轮纹病菌代谢物的影响  33-41
  4.1 材料与方法  33
    4.1.1 供试菌株  33
    4.1.2 主要试剂和仪器  33
    4.1.3 菌体培养和收集  33
    4.1.4 方法  33
  4.2 结果与分析  33-40
    4.2.1 戊唑醇连续处理对苹果轮纹病菌代谢物的影响  33-35
    4.2.2 紫外线处理对苹果轮纹病菌代谢物的影响  35-36
    4.2.3 电磁波处理对苹果轮纹病菌代谢物的影响  36-38
    4.2.4 水杨酸处理对苹果轮纹病菌代谢物的影响  38-40
  4.3 结论与讨论  40-41
第五章苹果轮纹病菌 ITS、Β-TUBULIN 和 EF-1Α基因的检测  41-50
  5.1 材料与方法  41-43
    5.1.1 供试菌株  41
    5.1.2 主要试剂  41-42
    5.1.3 菌体培养和收集  42
    5.1.4 菌体基因组总 DNA 提取  42
    5.1.5 ITS、β-tubulin 和 EF-1 基因的 PCR 扩增及电泳检测  42-43
    5.1.6 核苷酸序列的测定  43
    5.1.7 序列对比和系统发育树的构建  43
  5.2 结果与分析  43-49
    5.2.1 EF-1α基因序列分析  43-45
    5.2.2 ITS 序列分析  45-46
    5.2.3 β-tubulin 基因序列分析  46-48
    5.2.4 ITS 基因在不同处理前后序列的比较  48-49
  5.3 结论与讨论  49-50
第六章结论与创新点  50-51
  6.1 结论  50
  6.2 创新点  50-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
导师简介  58-59
个人简介  59-60
附图  60-62
附录  62-72

苹果轮纹病菌对戊唑醇抗性的遗传稳定性研究

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