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辣椒疫霉拮抗真菌毛壳菌和青霉菌的分离鉴定及其生防潜力的研究

作　者: 刘永亮
导　师: 高克祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 辣椒疫霉生物防治发酵液抗生物质抗药性毛壳菌青霉菌
分类号: S436.418.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

辣椒疫病是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）侵染引起的，一种常见的土传真菌病害，在全世界范围内均有发生。随着我国辣椒的种植与发展，全国各省市辣椒生产基地均受到此病害的影响，呈逐年加重发展趋势，造成严重的经济损失，阻碍了辣椒产业的发展。目前，已经探明该病害的病原菌侵染模式、致病条件及病害发生发展规律，在栽培措施的改进、抗病品种的筛选和化学药剂防治等方面取得了一系列的研究成果。但因管理措施复杂，抗病性辣椒品种遗传稳定性低，化学防治存在环境污染、抗药性及药物残留等问题，还不能有效地控制该病害的发生与危害。而拮抗微生物对环境友好，具有抑制病原菌生长与繁殖、诱导植物抗病等作用，因此利用微生物来防治辣椒疫病的发生与危害，引起研究人员的重视。本文从8种不同植物中分离获得了7株毛壳菌，12株青霉菌，结合本实验室自主保存的2株毛壳菌，进行拮抗辣椒疫霉菌株的筛选，研究探索拮抗毛壳菌株与青霉菌株的防病效果与生防机理，研究结果如下：1.通过与8种病原菌对峙试验、菌落降解试验及辣椒疫病防治试验，从9株毛壳菌和12株青霉菌中筛选出三株拮抗效果较强的菌株，即毛壳菌株HTC、青霉菌株P1与P2。对峙试验中，菌株HTC、P1和P2与辣椒疫霉菌落之间存在营养竞争、抑菌物质拮抗与重寄生三重作用机理，对辣椒疫霉的抑制率分别为60.4%、58.0%、57.0%；防病试验中，对辣椒疫病的防治效果分别为69.19%、63.68%、63.93%。2.结合菌株的形态学与18S rDNA分子生物学的鉴定结果，将毛壳菌株HTC定名为金色毛壳菌（Chaetomium aureum）；青霉菌株P1暂定为正青霉属（Eupenicillium）的真菌；菌株P2暂定为青霉属（Penicillium）的真菌。3.菌株HTC、P1与P2的发酵液与抗生物质粗提液对辣椒疫霉不同发育阶段均有较强抑制作用，各菌株的发酵液与抗生物质粗提液，对辣椒疫霉菌落生长的抑制率近100%；P2菌株发酵液对游动孢子的产生与释放的抑制率最高，分别为82.19%和80.46%；P1菌株抗生物质粗提液对游动孢子的萌发抑制率高达98.45%。4.菌株HTC发酵液与抗生物质粗提液，对辣椒疫病的防治效果均达70%以上，经HTC发酵液处理后，可以增强辣椒植株内过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，延缓辣椒植株因辣椒疫霉侵染引起该三种酶活性突然升高的趋势，提高植株的抗病性。5.菌株HTC、P1与P2的发酵液均可促进辣椒苗与植株的生长，增加植株叶片中叶绿素的含量，其中P1菌株发酵液对幼苗干重增加效果为21.05%，均可提高组织含水量，增强植株的抗逆性。6.菌株HTC、P1和P2的菌落均可在660μg/ml的甲霜灵与100μg/ml烯酰吗啉的平板上生长，此时烯酰吗啉完全抑制了辣椒疫霉菌落的生长，对毛壳菌LJ菌落的抑制率为66.50%；同浓度下两类药剂，对菌株HTC子囊孢子的萌发有延迟作用，未发现对孢子有破坏作用，此时烯酰吗啉对辣椒疫霉游动孢子萌发的抑制率为91.87%。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-26
  1.1 辣椒疫病的研究进展  13-17
    1.1.1 病害症状描述  13-14
    1.1.2 病原菌  14
    1.1.3 辣椒疫霉生活史  14
    1.1.4 辣椒疫霉交配型及分布  14-15
    1.1.5 辣椒疫霉致病力分化  15
    1.1.6 辣椒疫霉菌的侵染和致病机理  15-16
      1.1.6.1 侵染  15-16
      1.1.6.2 致病机理  16
    1.1.7 辣椒疫病病原菌的分布与季节性变化及病害循环  16-17
      1.1.7.1 分布与季节性变化  16
      1.1.7.2 病害循环  16-17
  1.2 辣椒疫病的防治  17-22
    1.2.1 抗病育种  17
    1.2.2 农业防治措施  17-18
    1.2.3 化学药剂防治  18
    1.2.4 诱导剂的应用  18
    1.2.5 利用基因工程技术  18-19
    1.2.6 生物防治  19-22
      1.2.6.1 芽孢杆菌属  19-20
      1.2.6.2 类芽孢杆菌属  20
      1.2.6.3 假单胞菌属  20
      1.2.6.4 木霉  20
      1.2.6.5 放线菌  20-21
      1.2.6.6 小单孢菌属  21
      1.2.6.7 青霉属  21
      1.2.6.8 曲霉属  21-22
  1.3 生物防治的机理  22-25
    1.3.1 生态位点的竞争  22
    1.3.2 抑菌物质的拮抗作用  22-23
    1.3.3 诱导植物抗病性  23
    1.3.4 重寄生作用  23-24
    1.3.5 调节微生态平衡  24-25
    1.3.6 促进植物生长  25
  1.4 研究目的与意义  25-26
2 材料与方法  26-35
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 样品采集  26
    2.1.2 供试真菌  26
      2.1.2.1 植物病原菌  26
      2.1.2.2 实验室已保存的毛壳菌  26
    2.1.3 供试植物品种  26
    2.1.4 供试培养基  26-27
    2.1.5 主要仪器设备  27
  2.2 方法  27-35
    2.2.1 毛壳菌与青霉菌株的分离  27-28
    2.2.2 拮抗毛壳菌株与青霉菌株的筛选  28
      2.2.2.1 对峙培养法  28
      2.2.2.2 降解辣椒疫霉菌丝法  28
    2.2.3 辣椒疫霉游动孢子致病浓度筛选  28-29
      2.2.3.1 辣椒疫霉游动孢子悬浮液的制备  28
      2.2.3.2 辣椒疫霉游动孢子浓度致病力筛选  28-29
    2.2.4 毛壳菌与青霉菌对辣椒疫病防治效果  29
      2.2.4.1 毛壳菌与青霉菌株发酵液的制备  29
      2.2.4.2 辣椒疫病防治试验  29
    2.2.5 毛壳菌与青霉菌株的形态学鉴定  29-30
    2.2.6 毛壳菌与青霉菌株的分子生物学鉴定  30
      2.2.6.1 真菌基因组 DNA 的提取  30
      2.2.6.2 PCR 扩增  30
      2.2.6.3 PCR 产物纯化与连接转化  30
      2.2.6.4 所得序列分析  30
    2.2.7 拮抗真菌与辣椒疫霉的对峙试验与重寄生形象  30
    2.2.8 HTC、P1、P2 发酵液与抗生物质对辣椒疫霉不同发育阶段的影响  30-32
      2.2.8.1 HTC、P1、P2 真菌发酵液的制备  30
      2.2.8.2 HTC、P1、P2 真菌抗生物质粗提液的制备  30-31
      2.2.8.3 对辣椒疫霉菌丝生长的影响  31
      2.2.8.4 对辣椒疫霉游动孢子囊形成的影响  31
      2.2.8.5 对辣椒疫霉游动孢子释放的影响  31
      2.2.8.6 对辣椒疫霉游动孢子萌发的影响  31-32
    2.2.9 HTC、P1、P2 真菌发酵液与抗生物质对辣椒疫病的防治试验  32
    2.2.10 HTC 发酵液对辣椒植物诱导抗性试验  32
    2.2.11 菌株 HTC、P1、P2 发酵液对辣椒的促生试验  32
    2.2.12 菌株 HTC、P1、P2 不同处理对辣椒发病地块的防病促生试验  32-33
    2.2.13 甲霜灵与烯酰吗啉对 HTC、P1、P2、LJ 与 SD-33 影响  33
      2.2.13.1 甲霜灵与烯酰吗啉对菌落生长的试验  33
      2.2.13.2 甲霜灵与烯酰吗啉对 HTC、LJ 与 SD-33 孢子萌发的影响  33
    2.2.14 HTC 菌剂的初步研究与加工  33-35
      2.2.14.1 HTC 菌剂类型的选择  33
      2.2.14.2 HTC 固体菌剂材料的初步筛选  33-34
      2.2.14.3 透气性与光照对 HTC 固体材料 E 发酵影响  34-35
3 结果与分析  35-63
  3.1 毛壳菌与青霉菌株的分离结果  35
  3.2 拮抗毛壳菌与青霉菌株的筛选  35-36
    3.2.1 对峙培养法  35
    3.2.2 菌落降解法  35-36
  3.3 辣椒疫霉 SD-33 游动孢子悬浮液浓度的筛选  36-37
  3.4 毛壳菌株与青霉菌株发酵液防病试验  37-38
  3.5 毛壳菌与青霉菌株的形态学鉴定  38-43
    3.5.1 毛壳菌 HTC  38-40
    3.5.2 青霉菌 P1  40-41
    3.5.3 青霉菌 P2  41-43
  3.6 毛壳菌与青霉菌株的分子生物学鉴定  43-45
    3.6.1 毛壳菌 HTC  43
    3.6.2 青霉菌 P1  43-44
    3.6.3 青霉菌 P2  44-45
  3.7 HTC、P1、P2 与辣椒疫霉 SD-33 对峙试验及重寄生现象  45-47
  3.8 HTC、P1 与 P2 发酵液与抗生物质对辣椒疫霉不同发育阶段的影响  47-52
    3.8.1 对辣椒疫霉菌丝生长的影响  47-48
    3.8.2 对辣椒疫霉游动孢子囊形成的影响  48-50
    3.8.3 对辣椒疫霉游动孢子释放的影响  50-51
    3.8.4 对辣椒疫霉游动孢子萌发的影响  51-52
  3.9 HTC、P1、P2 发酵液与抗生物质粗提液对辣椒疫病的防治效果  52-53
  3.10 HTC 发酵液对辣椒幼苗的诱导抗病性  53-54
  3.11 菌株 HTC、P1、P2 发酵液对辣椒的促生试验  54-55
  3.12 菌株 HTC、P1、P2 不同处理对辣椒发病地块的防病促生试验  55-59
  3.13 甲霜灵与烯酰吗啉对 HTC、P1、P2、LJ 与 SD-33 影响  59-61
    3.13.1 对 HTC、P1、P2、LJ 与 SD-33 的菌落生长的影响  59-60
    3.13.2 对 HTC、LJ 与 SD-33 的孢子萌发的影响  60-61
  3.14 HTC 固体菌剂的初步研究  61-63
    3.14.1 菌剂类型的初步筛选  61-62
    3.14.2 固体发酵材料筛选  62
    3.14.3 发酵材料 E 培养条件的测试  62-63
4 结论  63-65
5 讨论  65-69
  5.1 毛壳菌株与青霉菌株的分离与拮抗辣椒疫霉菌株的筛选  65
  5.2 菌株 HTC、P1、P2 和辣椒疫霉对峙试验与重寄生现象  65
  5.3 HTC、P1、P2 发酵液与抗生物质对辣椒疫霉不同发育阶段的影响  65-66
  5.4 防病促生试验  66-67
  5.5 对甲霜灵与烯酰吗啉抗药性的研究  67-69
参考文献  69-79
附录  79-81
致谢  81-83

辣椒疫霉拮抗真菌毛壳菌和青霉菌的分离鉴定及其生防潜力的研究

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