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大豆疫霉组蛋白乙酰转移酶相关基因PsGCN5的克隆与功能分析

作　者: 李毛毛
导　师: 高智谋
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 大豆疫霉 RNAi 组蛋白乙酰转移酶 PsGCN5 表型分析
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大豆疫霉（Phytophthorasojae）是大豆生产中具有毁灭性的植物病原菌之一，每年导致全球大豆生产的严重减产。近几年随着利用RNA干扰技术（RNAi）在大豆疫霉的转化体系的逐渐成熟和大豆疫霉全基因组测序的完成，大豆疫霉已经成为了研究卵菌中相关功能基因的模式菌株。组蛋白乙酰基转移酶（Histoneacetyltransferase,HATs)在生物体中具有重要的作用，通过与组蛋白去乙酰基酶(HistoneDeacetylase,HDAC)的相互作用实现了生物体内基因组整体水平的调控。HATs和HDAC主要通过对组蛋白中H3、H4核心组蛋白中Lys残基的乙酰化和去乙酰化，实现调控不同功能基因的表达。目前对HATs研究较多的为GCN5基因，它是HATs家族中具有代表性的一种调控基因。在疫霉属中，GCN5编码的氨基酸残基具有高度的同源性，特别是在编码的蛋白结构域和组蛋白乙酰赖氨酸残基结合位点在内的345个氨基酸同源性在97%以上，但是GCN5编码的氨基酸序列在不同物种之间却具有明显的差异性。通过对大豆疫霉无性生活史阶段以及侵染阶段中PsGCN5的qRT-PCR分析表明，PsGCN5在无性生活史各个时期相对于菌丝阶段表达量均处于下调状态，而在侵染阶段后期有一定程度的上调，在侵染时间为12h时，其表达量具有明显的上调变化，约为菌丝阶段的2.8倍，说明在大豆疫霉侵染阶段后期起到正调控作用。本实验通过扩增大豆疫霉中PsGCN5氨基酸残基的保守编码基因序列，构建PsGCN5沉默表达载体，利用PEG介导的大豆疫霉转化实验获得该基因的沉默突变体并命名为T37，T66，T68，对该菌株提取RNA并利用qRT-PCR验证得出，通过筛选的沉默突变体具有良好的沉默抑制效果。在利用已获得的沉默突变体进行表型分析结果中得出，在10%V8培养基中培养条件下，沉默突变体的生长情况无明显差异变化，且其游动孢子的形成和萌发率以及卵孢子的形成也未发生变化。在含有5mMH2O2、0.01%SDS和0.7MNaCl的10%V8培养基中培养条件下，沉默突变体的生长均受到明显的抑制。在对大豆寄主进行活体以及叶片离体侵染实验结果分析得出，该基因的沉默突变体的致病性具有明显的降低。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
0 文献综述  9-19
  0.1. 卵菌简介  9-10
  0.2 大豆疫霉概述  10-12
    0.2.1. 大豆疫病的发生概况  10
    0.2.2 大豆疫霉的生活史  10-12
    0.2.3 大豆疫霉的致病机理  12
  0.3 RNA 干扰技术介绍  12-14
    0.3.1. RNAi 技术的发展  12-13
    0.3.2 RNAi 效应机理  13-14
  0.4 疫霉中利用 RNAi 介导的基因沉默研究进展  14-15
  0.5 组蛋白乙酰转移酶（ HATs）研究进展  15-19
1 引言  19-21
2 材料与方法  21-30
  2.1. 实验材料  21-22
    2.1.1. 供试菌株  21
    2.1.2 供试大豆品种  21
    2.1.3 培养基  21
    2.1.4 主要生化试剂及溶液配制  21-22
    2.1.5 主要供试仪器  22
  2.2 实验方法  22-30
    2.2.1. 大豆疫霉各个时期 RNA 样品的准备  22-23
    2.2.2 大豆疫霉卵孢子的培养  23-24
    2.2.3 基因组 DNA 的提取  24
    2.2.4 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备（SSCS法）16  24
    2.2.5 RNA 的提取  24-25
    2.2.6 cDNA 的反转录  25
    2.2.7 PsGCN5 目的片段的克隆  25-26
    2.2.8 PsGCN5 沉默载体的构建  26
    2.2.9 PsGCN5 目的片段电泳回收  26
    2.2.10 PsGCN5 质粒回收  26
    2.2.11 pHAM34-PsGCN5 质粒回收  26-27
    2.2.12 大豆疫霉转化  27-28
    2.2.13 PsGCN5 沉默转化子的筛选 20  28
    2.2.14 野生菌株中 PsGCN5 表达量 RT-PCR 分析  28
    2.2.15 PsGCN5 沉默转化子致病性分析  28-29
    2.2.16 PsGCN5 沉默转化子相关表型分析  29-30
3 结果与分析  30-39
  3.1 PsGCN5 基因的克隆及氨基酸序列分析  30-32
  3.2 PsGCN5 在生活史阶段与侵染阶段的转录的表达分析  32-33
  3.3 PsGCN5 基因片段克隆及转化载体的构建  33-34
  3.4 PsGCN5 沉默突变体的筛选  34-36
  3.5 PsGCN5 沉默突变体的表型分析  36-39
    3.5.1 PsGCN5 沉默突变体的菌丝生长  36
    3.5.2 PsGCN5 沉默突变体的游动孢子的变化  36-37
    3.5.3 PsGCN5 沉默突变体的卵孢子的变化  37
    3.5.4 PsGCN5 沉默突变体胁迫条件下的生长  37-38
    3.5.5 PsGCN5 沉默突变体致病性的测定  38-39
4 讨论  39-40
5 结论  40-41
6 参考文献  41-48
致谢  48-49
作者简介  49
[附] 攻读硕士学位期间已发表的学术论文  49

大豆疫霉组蛋白乙酰转移酶相关基因PsGCN5的克隆与功能分析

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