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大豆疫霉Ras GTPase蛋白PsARF1的功能研究

作　者: 黄轶丹
导　师: 王源超
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉小G蛋白ARF1 基因沉默致病性
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大豆是世界上重要的经济作物之一,大豆疫霉(Phytophthora sojae)能够侵染大豆引起幼苗猝倒和成株的根腐病,给世界的大豆产业带来了巨额的经济损失。该菌的无性生活史对于病害在大田里迅速流行起着重要的作用,随着大豆疫霉全基因组测序的完成,研究者可以在分子水平上对基因的转录模式进行研究分析,为完善人们对大豆疫霉分子致病机制的了解提供了新的研究方法。大豆疫霉在侵染植物的过程中会产生大量的效应分子来破坏植物的抗病性,而植物则会通过抗病基因识别这些效应分子做出反应,明确这些效应分子从大豆疫霉细胞内到细胞外的分泌途径十分重要。囊泡运输是细胞内物质转运的一种基本运输方式根据其衣被蛋白的不同分为COPI.COPII和网格蛋白衣被囊泡三种,COPI衣被囊泡主要负责高尔基体到内质网的物质运输。ARF1是小G蛋白Ras家族的成员,它是COPI衣被囊泡形成所不可缺少的,也是膜转运过程的重要调控因子。本文利用生物信息学方法在大豆疫霉基因组中预测到了编码ARF1的基因,通过分析发现该基因在进化过程中是高度保守的。对这个基因在大豆疫霉5个无性发育阶段和5个侵染阶段的表达水平进行了分析,发现它在这十个阶段都有表达,但在侵染阶段具有较高的转录水平,该结果说明PsARF1在大豆疫霉侵染过程中发挥了重要作用。本研究通过PEG介导的原生质体转化方法在大豆疫霉菌P6497(race2)中对PsARF1进行稳定转化,筛选到3个沉默突变体。用沉默突变体接种大豆黄化苗下胚轴可观察到突变体致病能力明显减弱,且病斑在创伤和非创伤大豆黄化苗下胚轴上的扩展能力都受到一定的抑制,通过显微观察证实沉默突变体菌丝穿透黄化苗表皮层的能力和在细胞间扩展的能力较野生型明显减弱,说明PsARF1在大豆疫霉侵染寄主的过程中发挥了重要作用。通过对沉默突变体的表型分析发现PsARF1的沉默会影响菌落的生长速率及休止孢的萌发,但并不会影响其细胞壁的完整性。进一步的实验观察发现沉默突变体清除过氧化氢及胼胝质的能力明显减弱,说明PsARF1的沉默能影响大豆疫霉对植物基础防卫反应的有效应答。同时发现突变体胞内酶漆酶的分泌量也明显减少。大量研究表明,PsARF1在大豆疫霉蛋白外泌过程中发挥了重要作用,且它是大豆疫霉生长发育以及致病过程中的一个重要调控因子。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-31
  第一章小G蛋白的概述  11-19
    1 G蛋白与小G蛋白  11
    2 小G蛋白的分类  11-14
      2.1 Ras家族简介  12
      2.2 Rho家族简介  12-13
      2.3 Rab和Arf/Sar家族简介  13-14
      2.4 Ran家族简介  14
    3 小G蛋白的调节因子  14-16
    参考文献  16-19
  第二章 ARF家族的功能研究  19-31
    1 ARF与COPI衣被囊泡运输  19-23
      1.1 COPI衣被囊泡运输概述  19-21
      1.2 ARF的结构与功能  21-23
    2 ARF的功能研究进展  23-25
      2.1 酵母中的ARF蛋白  23-24
      2.2 植物中的ARF蛋白  24
      2.3 哺乳动物中的ARF蛋白  24-25
    3 卵菌基因功能研究的主要方法——基因沉默  25-27
    参考文献  27-31
下篇研究内容  31-64
  第一章大豆疫霉ARF1生物信息学分析及转录分析  32-40
    摘要  32
    ABSTRACTS  32-33
    1 材料与方法  33-35
      1.1 供试菌株与植物材料  33
      1.2 数据库信息搜索和同源性比对  33-34
      1.3 多重比对和系统发育分析  34
      1.4 大豆疫霉各时期转录分析样品的准备  34
      1.5 RNA的提取  34-35
    2 结果与分析  35-37
      2.1 不同物种中ARF1的序列比对分析  35-37
      2.2 PsARF1在各生活史阶段的转录分析  37
    3 讨论  37-39
    参考文献  39-40
  第二章大豆疫霉PsARF1与调控生长和致病性  40-64
    摘要  40
    ABSTRACTS  40-41
    1 材料与方法  41-50
      1.1 供试菌株  41-42
      1.2 试剂及培养基  42-44
      1.3 稳定转化载体的构建  44
      1.4 大豆疫霉遗传转化  44-47
      1.5 PsARF1沉默突变体的筛选  47-48
      1.6 PsARF1沉默突变体的表型分析  48
      1.7 致病性测定  48-49
      1.8 漆酶产量测定  49
      1.9 氧化压力敏感性试验  49
      1.10 休止孢萌发的细胞壁染色  49
      1.11 菌丝的Trypan Blue的染色观察  49
      1.12 大豆黄化苗下胚轴表皮细胞胼胝质沉积的染色观察  49
      1.13 大豆黄化苗下胚轴表皮细胞活性氧沉积的染色观察  49-50
    2 结果与分析  50-61
      2.1 PsARF1沉默突变体的筛选  50-51
      2.2 PsARF1沉默突变体萌发的休止孢表型分析  51-53
      2.3 PsARF1突变体生长速率减慢  53-54
      2.4 PsARF1沉默突变体对渗透压的敏感性增强  54-55
      2.5 PsARF1沉默突变体致病性测定  55-58
      2.6 PsARF1影响大豆疫霉清除活性氧和胼胝质的能力  58-60
      2.7 PsARF1突变体胞外漆酶分泌量减少  60-61
    3 讨论  61-63
    参考文献  63-64
附录  64-68
攻读硕士学位期间发表的研究论文  68-70
致谢  70

大豆疫霉Ras GTPase蛋白PsARF1的功能研究

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