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水稻条纹病毒NSvc2基因产物的原核表达、抗体制备及特性分析

作　者: 孙丽娟
导　师: 范永坚
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻条纹病毒 NSvc2基因产物 抗体制备 酵母双杂交cDNA文库构建
分类号: S435.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


由灰飞虱传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的水稻条纹叶枯病是目前水稻生产上的重要病毒病,该病在我国的分布极为广泛,给水稻生产带来巨大的损失。目前,灰飞虱传播RSV的机制还不清楚,研究灰飞虱传毒机制对于切断病毒的传播、控制该病毒病害具有重要意义。由于RSV与TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV)的基因组结构相似,并且RSV编码的NSvc2蛋白与TSWV的膜糖蛋白(参与蓟马传播的决定因子)相对应,因此,作者推测NSvc2乏可能是RSV参与介体灰飞虱传播的决定因子。为了弄清NSvc2勺功能,本研究首先分析该基因的拓扑结构,采用RT-PCR从感染RSV的水稻中克隆获得基因R-GN、R-GC、R-GNS和R-GCS。借助原核表达载体构建了R-GN、R-GC、R-GNS和R-GcS的融合蛋白原核表达重组子,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)并诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物与预期结果大小一致。进一步制备了R-GNS和R-GCS勺抗血清,Western-blot结果显示,所制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。然后利用获得的抗血清检测了NSvc2蛋白在RSV感病水稻和带毒灰飞虱中的表达情况,结果发现,NSvc2蛋白在水稻和灰飞虱体内以2种不同的形式存在,在水稻中NSvc2蛋白存在切割现象,被切割成2个蛋白R-GN (40kDa)和R-Gc(53或56kDa),在灰飞虱体内NSvc2的产物不再被切割,而以94kDa的完整蛋白形式存在。本研究应用酵母双杂交技术分析了RSV-CP与NSvc2基因产物R-GN、R-Gc之间的互作关系,结果显示,R-GN、R-GC蛋白均与RSV-CP存在互作关系,而R-GN和R-Gc之间不存在互作关系,这为证明NSvc2是RSV参与灰飞虱传播的决定因子这一推测打下了基础。此外,本论文还以实验室多代筛选获得的高带毒(RSV)灰飞虱群体为材料参与构建了酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明：文库库容量为3.68x107cfu,扩增文库滴度为2.62×1010cfu/mL,文库重组率大于95%,cDNA插入片段平均长度>1kb,达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第一部分 文献综述  9-26
  1 水稻条纹病毒的研究概况  10-18
    1.1 寄主范围、症状及分布  10-12
    1.2 病毒粒子分类地位及性状  12
    1.3 水稻条纹病毒的分子生物学研究概况  12-18
      1.3.1 病毒基因组的结构与编码策略  12-13
      1.3.2 RSV编码的蛋白及功能  13-18
  2 植物病毒介体昆虫传播机制的研究进展  18-24
    2.1 非循回型植物病毒介体昆虫传播机制  18-20
    2.2 循回型植物病毒介体昆虫传播机制  20-24
      2.2.1 循回增殖型植物病毒介体昆虫传播机制  20-21
      2.2.2 循回非增殖型植物病毒介体昆虫传播机制  21-24
  3 膜糖蛋白在介体传播病毒过程中的作用  24-26
第二部分 研究内容  26-63
  第一章 水稻条纹病毒NSVC2基因产物的原核表达、抗体制备及检测  27-49
    1.1 材料与方法  28-39
      1.1.1 材料  28-29
      1.1.2 方法  29-39
    1.2 结果与分析  39-47
      1.2.1 R-G_N与R-G_C基因的RT-PCR扩增  39
      1.2.2 R-G_N与R-G_C基因的克隆  39-40
      1.2.3 R-G_N与R-G_C基因的原核表达  40-41
      1.2.4 R-G_NS与R-G_CS基因的克隆  41
      1.2.5 R-G_NS与R-G_CS基因原核表达载体构建  41
      1.2.6 R-G_NS与R-G_CS蛋白的表达纯化、SDS-PAGE及Western-blot分析  41-43
      1.2.7 R-G_NS与R-G_CS多克隆抗体的效价与特异性  43-45
      1.2.8 检测NSVC2蛋白在水稻与灰飞虱体内表达的情况  45-47
    1.3 小结与讨论  47-49
  第二章 RSV CP与RSV-G_N、RSV-G_C的互作研究  49-57
    2.1 材料与方法  49-53
      2.1.1 材料  49-50
      2.1.2 方法  50-53
    2.2 结果与分析  53-55
      2.2.1 RSV CP基因的克隆  53
      2.2.2 CP与R-G_N、R-G_C酵母表达载体的构建  53-54
      2.2.3 CP与R-G_N、R-G_C两蛋白之间的互作检测  54-55
    2.3 小结与讨论  55-57
  第三章 灰飞虱高带毒(RSV)群体酵母双杂交CDNA文库的构建  57-63
    3.1 材料与方法  57-59
      3.1.1 材料  57-58
      3.1.2 方法  58-59
    3.2 结果与分析  59-61
      3.2.1 灰飞虱总RNA的提取及mRNA的分离纯化  59-60
      3.2.2 双链CDNA的合成及纯化  60
      3.2.3 CDNA入门文库的鉴定  60
      3.2.4 酵母双杂交CDNA文库的鉴定  60-61
    3.3 小结与讨论  61-63
参考文献  63-71
附录Ⅰ 常用生化及分子生物学试剂与仪器  71-72
附录Ⅱ 常用缓冲液及试剂配方  72-74
攻读硕士期间发表的文章  74-75
致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害
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