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水稻病原菌诱导型启动子OsB3p和OsQ16p的克隆与功能分析

作　者: 王光
导　师: 邵敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 转基因水稻 诱导型启动子 GUS 稻瘟病菌
分类号: S435.111
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


对本实验室通过抑制消减杂交(SSH)的方法获得的两个稻瘟病菌诱导表达的上调基因OsB3和OsQ16进行qRT-PCR验证,结果表明OsB3和OsQ16基因在稻瘟病菌诱导下表达量均明显上升；利用生物信息学方法分析这两个基因上游1500bp左右的启动子片段,通过PlantCARE软件预测发现在此区域内除了存在高等植物的保守元件TATA-box和CAAT-box外,还包含许多与植物逆境应答反应密切相关的顺式作用元件,如ARE、TGACG-motif和MBS等。推测其上游启动子序列可能具有稻瘟病菌诱导的启动活性。利用聚合酶链式反应(PCR)技术,以日本晴基因组为模板,分别克隆OsB3和OsQ16基因的启动子OsB3p(1441bp)和OsQ16p(1299bp),将克隆到的启动子片段分别取代pBI121载体中的gus基因上游35S启动子,构建重组质粒pBIB1.4p和pBIQ16p。同时针对OsB3p启动子做一系列5’端缺失片段分析(ATG上游942bp、676bp和436bp),将启动子缺失片段分别取代pBI121中的35S启动子,构建pBIB0.9p、pBIB0.6p和pBIBO.4p共3套重组表达载体。将构建好的5套重组表达载体通过冻融法转化农杆菌EHA105,提质粒测序验证后,经农杆菌介导转化日本晴,筛选培养,分化成再生植株。对获得的转基因水稻植株扩增gus基因进行PCR验证。对PCR呈阳性的植株进行Southern blot杂交,结果显示转基因构建已经整合到水稻基因组中。GUS组织化学染色结果表明由OsB3p及其缺失体启动子驱动的gus基因均能在抗性愈伤组织、根、茎、叶、叶鞘和颖壳中表达；对OsB3p及其缺失体启动子的转基因植株进行喷稻瘟病菌孢子处理,GUS荧光定量分析及qRT-PCR分析发现,pBIN1.4p、pBIN0.9p和pBIN0.6p的转基因植株在稻瘟病菌诱导12-24h时,叶片中的GUS表达量均明显上升,而pBINO.4p转基因植株在处理前后无明显变化。对启动子OsQ16p的转基因植株进行GUS组织化学染色和荧光定量结果表明,抗性愈伤组织、根、茎、叶、叶鞘和颖壳均可以表达。稻瘟病菌处理转基因植株12h后,GUS活性明显升高,是处理前的2.7倍。5mM的水杨酸(SA)和0.5mM茉莉酸甲酯(MeJA)喷施转基因植株叶面12h后,GUS活性分别为处理前的3.1倍和3.5倍。由此表明启动子OsB3p和OsQ16p能驱动外源基因在转基因植株中表达,并具有一定的诱导活性,属于诱导型启动子,受稻瘟病菌或SA和MeJA等因子的诱导。本研究鉴定出的OsB3p和OsQ16p启动子序列具有受稻瘟病菌诱导驱动外源基因表达的功能,为实现抗病相关基因在转基因作物中的诱导表达提供理论及实验依据。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-24
  第一节 高等植物启动子的研究进展  10-15
    1 植物启动子的结构特征及分类  10-13
    2 植物启动子的克隆方法  13-14
    3 启动子的分析与预测和研究中使用的报告基因  14-15
  第二节 水稻抗稻瘟病的研究进展  15-19
    1 稻瘟病的研究现状  15-16
    2 水稻稻瘟病抗性基因研究进展  16-18
    3 水稻稻瘟病抗性基因的克隆及特征  18-19
    4 水稻抗稻瘟病的分子育种  19
  第三节 水稻遗传转化研究进展  19-24
    1 常用的基因转化方法  20-22
    2 水稻转化受体系统  22-24
第二章 启动子OsB3p的克隆及其区域功能分析  24-50
  摘要  24-25
  1 材料和方法  25-39
    1.1 材料  25-26
    1.2 启动子序列生物信息学分析  26
    1.3 启动子序列的克隆  26-27
    1.4 重组表达载体的构建  27-30
    1.5 重组质粒转化农杆菌  30-31
    1.6 农杆菌介导转化水稻  31-33
    1.7 转基因水稻的检测  33-36
    1.8 转基因水稻的稻瘟病菌处理  36-37
    1.9 GUS荧光定量分析及gus基因的表达水平分析  37-39
  2 结果与分析  39-47
    2.1 稻瘟病菌诱导OsB3基因表达分析  39
    2.2 OsB3p启动子序列分析  39-42
    2.3 OsB3p启动子及5’端缺失表达载体的构建和鉴定  42
    2.4 转基因水稻的获得及检测  42-44
    2.5 pBIB1.4p转基因系GUS表达水平检测  44-45
    2.6 OsB3p启动子中响应稻瘟病菌诱导的启动子区域分析  45-47
  3 讨论  47-50
第三章 启动子OsQ16p诱导功能分析  50-62
  摘要  50-51
  1 材料和方法  51-52
    1.1 OsQ16p启动子序列的克隆和生物信息学分析  51-52
    1.2 水稻的遗传转化及转基因植株的PCR检测  52
    1.3 水稻的稻瘟病菌、茉莉酸甲酯和水杨酸处理  52
    1.4 GUS组织化学染色及qRT-PCR对gus基因表达水平分析  52
  2 结果与分析  52-60
    2.1 稻瘟病菌诱导OsQ16基因表达分析  52-53
    2.2 启动子的顺式作用元件分析  53-56
    2.3 OsQ16p启动子的克隆与鉴定  56-57
    2.4 转基因水稻的获得及检测  57-58
    2.5 OsQ16p启动子转基因系GUS表达水平检测  58-60
  3 讨论  60-62
全文总结  62-64
参考文献  64-72
附录  72-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的学术论文  75

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害
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