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番茄SlIAA9、SlIAA14基因启动子克隆及功能分析

作　者: 李小靖
导　师: 陈银华；张俊红
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 番茄 SlIAA9基因 SlIAA14基因启动子分析 YFP,GUS表达
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

真核生物基因表达调控是分子生物学研究的热点。基因表达的程序、时间和位置在不同层次上受不同调节因素的控制,这种复杂的控制机制决定了基因的表达水平和表达的时空顺序,其中以转录水平上的调控最为重要。因此,对启动子结构及调控模式的深入了解不仅具有重大的理论意义而且还对基因工程产业化发展具有重要的现实意义。番茄(Solanum lycopersicum)是一种在世界被广泛种植的蔬菜,同时,它也是植物基因工程研究的一种模式植物,在基础研究方面已进行的比较深入,其遗传转化体系也已经成熟,有利于本试验的进行。本研究利用同源序列法及染色体步移技术获得了番茄AUX／IAA家族SlIAA9、SlIAA14基因5’端上游PSlIAA9及PSlIAA14启动子片段。构建这两个片段和YFP-GUS基因融合的植物表达载体SlIAA9：：GUS+YFP,SlIAA14：：GUS+YFP以及PSlIAA9驱动的SlIAA9基因超量表达载体SlIAA9：：SlIAA9,并通过农杆菌介导法的转基因方法转化番茄,利用转基因手段分析SlIAA9及SlIAA14基因启动子的结构特征及其表达模式,为进一步深入了解生长素调控番茄生长发育的分子机理,揭示番茄中SlIAA9及SlIAA14基因的生物学功能及其可能的作用机制奠定了基础。本研究获得的主要结果如下：1.PCR扩增获得了SlIAA9基因启动子区域长为1891 bp的PSlIAA9序列及SlIAA14基因长2197 bp的PSlIAA14启动子序列,生物信息学分析表明,所获得的序列片段上含有响应脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素作用和响应干旱和伤害等逆境胁迫等多种作用元件。2.构建了PSlIAA9和PSlIAA14启动子片段与YFP+GUS的蛋白融合载体SlIAA9：：GUS+YFP,SlIAA14：：GUS+YFP,及PSlIAA9驱动的SlIAA9基因超量表达载体SlIAA9：：SlIAA9。3.通过农杆菌介导法转化番茄Ailsa Craig子叶获得了多株3个载体的转基因植株。4.通过体视荧光显微镜观察及GUS染色观察SlIAA9：：GUS+YFP,SliAA14：：GUS+YFP转基因植株叶片及根系中YFP和GUS蛋白的表达,发现其表达模式具有明显特异性,其中SlIAA9：：GUS+YFP载体主要集中在叶基部维管组织及侧根原基部位,而SlIAA14：：GUS+YFP载体主要集中在叶脉维管组织及根尖分生组织。5.观察SlIAA9：：SlIAA9番茄entire突变体转基因植株的表型,发现SlIAA9基因启动子驱动的SlIAA9基因并未恢复番茄entire突变的单叶表型,其可能原因尚待进一步的后续研究。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
缩略词表  6-7
目录  7-10
1.序言  10-20
  1.1 课题的提出  10-18
    1.1.1 植物生长素的生物活性  10-11
    1.1.2 生长素信号转导  11-18
      1.1.2.1 生长素受体  11-14
        1.1.2.1.1 生长素结合蛋白(ABPI)  11-13
        1.1.2.1.2 生长素运输抑制反应1(TIR1)  13-14
      1.1.2.2 生长素的信号转导机制  14-18
        1.1.2.2.1 生长素诱导的基因转录  14-16
        1.1.2.2.2 生长素响应因子ARFs结构及其功能  16-18
    1.1.3 对Aux/IAA基因功能的研究  18
  1.2 本研究目的和主要内容  18-20
    1.2.1 研究目的  18
    1.2.2 研究内容  18-20
第一章两个SLIAA基因的启动子克隆  20-31
  1.1 实验材料  20
    1.1.1 植物材料  20
    1.1.2 菌株与载体  20
  1.2. 仪器与试剂  20-21
    1.2.1 仪器  20
    1.2.2 试剂  20
    1.2.3 试剂配制  20-21
  1.3 实验方法  21-23
    1.3.1 同源序列法PCR扩增SlIAA9启动子DNA序列  21
      1.3.1.1 引物合成  21
      1.3.1.2 PCR反应体系的建立  21
    1.3.2 Genomic DNA walking获得SlIAA14基因启动子DNA序列  21-22
      1.3.2.1 特异引物合成  21
      1.3.2.2 PCR反应程序  21-22
    1.3.3 PCR扩增目的片段的克隆  22-23
      1.3.3.1 通用引物合成  22
      1.3.3.2 特异PCR产物的回收纯化  22
      1.3.3.3 回收的PCR产物与pEASY-T_1载体的连接  22-23
      1.3.3.4 PCR筛选阳性克隆  23
      1.3.3.5 测序  23
  1.4 结果与分析  23-31
    1.4.1 同源序列法扩增SlIAA9启动子DNA片段  23-24
    1.4.2 SlIAA9基因启动子的克隆  24
    1.4.3 SlIAA9基因启动子克隆片段的测序及分析  24-29
    1.4.4 Genomic DNA walking获得SlIAA14基因启动子DNA序列  29-31
第二章 IAA基因的特异启动子表达载体的构建  31-38
  2.1 实验方法  31-36
    2.1.1 载体大片段的准备  32
      2.1.1.1 pMV2G载体质粒酶切  32
      2.1.1.2 载体酶切回收产物去磷酸化  32
    2.1.2 启动子DNA片段的准备  32-34
      2.1.2.1 PCR获得P_(SlIAA9)和P_(SlIAA14)高保真片段  32-33
        2.1.2.1.1 引物合成  33
        2.1.2.1.2 PCR扩增P_(SlIAA9),P_(SlIAA14)片段  33
      2.1.2.2 P_(SlIAA9)及P_(SlIAA14)片段的克隆  33
      2.1.2.3 P_(SlIAA9)及P_(SlIAA14)启动子DNA片段的重组质粒提取  33
      2.1.2.4 P_(SlIAA9)及P_(SlIAA14)片段的双酶切  33-34
    2.1.3 载体酶切片段与启动子DNA片段P_(SlIAA9)及P_(SlIAA14)的连接  34
    2.1.4 连接产物转化大肠杆菌DH5a  34-35
      2.1.4.1 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备  34
      2.1.4.2 连接产物热激转化大肠杆菌  34
      2.1.4.3 转化子的PCR检测筛选  34-35
    2.1.5 重组质粒的提取及酶切鉴定  35
    2.1.6 表达载体SlIAA9::SlIAA9的构建  35-36
  2.2 结果与分析  36-38
第三章 IAA基因特异启动子转化番茄分析  38-44
  3.1 实验方法  38-40
    3.1.1 表达载体电激法转化农杆菌  38
      3.1.1.1 农杆菌电击感受态细胞的制备  38
      3.1.1.2 电激转化  38
      3.1.1.3 PCR鉴定阳性克隆  38
    3.1.2 番茄的遗传转化  38-40
      3.1.2.1 培养基的配制  38-39
      3.1.2.2 番茄遗传转化体系  39-40
    3.1.3 转基因植株的PCR阳性检测  40
      3.1.3.1 番茄转基因植株DNA的提取  40
      3.1.3.2 PCR检测转基因植株  40
      3.1.3.3 转基因番茄的炼苗移栽  40
  3.2 结果与分析  40-44
    3.2.1 农杆菌转化子的鉴定  40-42
    3.2.2 表达载体转化番茄植株  42
    3.2.3 转基因植株PCR检测  42-44
第四章启动子表达模式观察及番茄ENTIRE突变体恢复验证  44-48
  4.1 YFP荧光显微镜观察及GUS组织化学染色分析  44-47
    4.1.1 试剂配制  44
    4.1.2 实验方法  44-45
      4.1.2.1 YFP体视荧光显微镜观察  44
      4.1.2.2 GUS组织化学染色方法  44-45
    4.1.3 结果与分析  45-47
      4.1.3.1 显微镜观察转基因植株根系  45
      4.1.3.2 转基因植株的GUS染色  45-47
  4.2 SLIAA9::SLIAA9转番茄ENTIRE突变体植株观察  47-48
第五章讨论  48-50
  5.1 Genomic DNA walking及同源序列法扩增启动子DNA序列  48
  5.2 启动子结构特点及其元件分析  48-49
  5.3 启动子驱动基因的特异表达  49
  5.4 entire突变体叶型的恢复  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
附录  57-59
  附录1.番茄基因组DNA小量提取法  57-58
  附录2.质粒小量提取法  58
  附录3.连接产物转化大肠杆菌  58-59
  附录4.硕士在读期间发表的论文  59

番茄SlIAA9、SlIAA14基因启动子克隆及功能分析

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