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水稻细菌性条斑病菌中六个假定外泌蛋白的鉴定与致病功能研究

作　者: 张雁冰
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻细菌性条斑病菌 假定外泌蛋白 epv DSF 胞外多糖 致病性
分类号: S435.111
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）包括水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc）和水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo）两个致病变种。其中,Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病；Xoo从水稻的水孔侵入,引起白叶枯病。一直以来,细菌性条斑病和白叶枯病严重危害我国的水稻种植。目前,对Xoc致病机理的研究主要集中在群体感应受体蛋白编码基因LuxR、无毒基因（如AvrXa7）、Ⅲ型分泌系统及其转运的效应因子、双组分调控系统、DSF型群体感应调控系统等基因和系统的功能分析,对于假定外泌蛋白的研究则少有报道。通过生物信息学分析,我们从水稻条斑病菌的全基因组（X. oryzae pv. oryzicola strain BLS256）中找到了另外6个编码假定的外泌蛋白的基因（Xoryp010100004540, Xoryp10100011980, Xoryp10100015235, Xoryp010100018640, Xoryp010100020851和Xoryp010100022495）,有趣的是,这些蛋白缺席于水稻白叶枯细菌的全基因组当中,说明它们是一些新颖的对比于水稻白叶枯病菌是水稻条斑病菌中所独有的蛋白,并且它们在细菌致病性中扮演的角色还是未知的。（一）采用PCR的方法从Rs105基因组中克隆到上述6个基因,通过插入突变的方法,分别构建了这6个基因的突变株。用针刺接种法对水稻叶片进行接种,结果表明：与野生型相比,突变体AXoryp010100015235的致病性有显著性减弱。而对烟草叶片的致敏性则无明显改变。所以我们认为Xoryp010100015235是最优的致病相关基因。（二）从Rs105基因组中克隆到Xoryp010100015235基因,并证实这个基因在基因组中为单拷贝。用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的致病性和过敏性反应、菌体形态、游动性、胞外多糖与蛋白酶的产生能力、在水稻叶片中的繁殖能力以及生长能力等表型,研究显示Xoryp10100015235这个基因突变后可造成致病性的明显减弱和胞外多糖（水稻条斑病菌重要的毒力因子之一）产量的显著性降低,我们命名Xoryp10100015235为epv （extracellular polysaccharide and virulence related gene）。实时定量荧光PCR （qRT-PCR）显示基因gumB （编码胞外多糖生物合成最后一步的关键酶）和一个已报道的毒性相关基因pgk（编码磷酸甘油酸激酶）在epv的突变体中转录水平对比与野生型Rs105有显著性下调。此外,我们发现epv的转录水平在X. oryzae pv. oryzicola中受可扩散性信号分子（DSF）和全局调控因子Clp的正向调控。综上所述,首次报道epv这一新颖的致病相关基因,其在水稻细菌性条斑病菌中所扮演的角色是与胞外多糖产量和毒力密切相关。据我们所知,遗传学研究中关于epv在植物黄单胞菌属中有关其同系物的角色也无人报告。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
上篇 文献综述  11-34
  第一章 水稻细菌性条斑病菌的毒性因子及毒性相关的分泌系统  12-28
    第一节 毒性因子的鉴定  13-21
      1 外泌蛋白酶类  13-15
        1.1 蛋白酶(protease)  14
        1.2 纤维素酶(cellulase)  14-15
        1.3 果胶酶(pectic enzyme)  15
      2 胞外多糖  15-17
        2.1 CPS(capsular polysaccharide,CPS)  16
        2.2 LPS(Lipopolysaccharide,LPS)  16
        2.3 EPS(exopolysacchrides,EPS)  16-17
      3 生长调节物质  17-18
      4 毒素  18
      5 hrp基因与avr基因  18-20
      6 细胞外部的黏附装置  20-21
    第二节 毒性相关分泌系统及其底物  21-28
      1 Ⅰ型分泌系统是诱导Xa21介导抗性所必需的  22
      2 Ⅱ型分泌系统与胞外降解酶类  22-23
      3 Ⅲ型分泌系统(T3SS)是细菌致病性所必需的  23-28
        3.1 对于黄单胞Ⅲ型效应分子的鉴定  24-25
        3.2 黄单胞菌Ⅲ型效应蛋白对寄主细胞进程的干扰  25-28
  第二章 黄单胞菌毒性相关调控网络  28-34
    1 群体感应对黄单胞毒性基因表达的控制  28-33
      1.1 主要的细菌群体感应类型  28-30
      1.2 DSF型QS传导通路  30-33
    2 次生代谢物阻碍蛋白RsmA对毒性基因表达的转录后调控  33-34
下篇 研究内容  34-89
  第一章 6个假定外泌蛋白编码基因的克隆、突变及致病性测定  35-63
    摘要  35-36
    1 材料与方法  36-53
      1.1 供试菌株、质粒以及引物  36-38
      1.2 培养基及抗生素  38-39
      1.3 细菌基因组DNA的提取  39-41
      1.4 质粒的提取  41-42
      1.5 DNA操作体系  42-45
      1.6 质粒的转化  45-47
      1.7 Southern杂交  47-51
      1.8 突变体的构建  51-52
      1.9 致病性和过敏性反应的测定  52-53
      1.10 序列分析  53
      1.11 显著性差异分析  53
    2 结果与分析  53-62
      2.1 6个基因的克隆  53-54
      2.2 重组载体的构建  54-58
      2.3 6个基因突变体的构建  58-61
      2.4 6个突变株的致病性和HR测定  61-62
      2.5 6个突变株的过敏性反应测定  62
    3 讨论与结论  62-63
  第二章 epv基因的功能鉴定  63-89
    摘要  63-64
    1 材料与方法  64-72
      1.1 供试菌株、质粒以及引物  64-65
      1.2 培养基及抗生素  65
      1.3 细菌基因组DNA的提取  65
      1.4 质粒的提取  65
      1.5 DNA操作体系  65
      1.6 质粒的转化  65
      1.7 Southern杂交  65
      1.8 突变体的构建  65
      1.9 互补菌株的构建  65-67
      1.10 致病性和过敏性反应的测定  67
      1.11 游动性和趋化性试验  67-68
      1.12 细菌沉降性试验  68
      1.13 胞外蛋白酶的检测  68
      1.14 胞外多糖的检测  68
      1.15 生物膜的检测  68-69
      1.16 抗氧化压力的测定  69
      1.17 生长曲线的测定  69
      1.18 细菌在水稻叶片内的繁殖能力测定  69-70
      1.19 相对实时荧光定量PCR和反转录PCR  70-72
    2 结果与分析  72-87
      2.1 epv基因的克隆与重组载体的构建  72-73
      2.2 epv基因突变体的构建  73-75
      2.3 epv互补株的构建  75-76
      2.4 Southern杂交验证epv基因的独有性  76-77
      2.5 epv基因的突变影响细菌的致病性,但不影响HR反应  77-78
      2.6 epv基因的突变不影响细菌的正常生长  78-80
      2.7 epv基因的突变降低细菌胞外多糖(EPS)的产量  80
      2.8 epv基因的突变不影响胞外蛋白酶生物合成  80-81
      2.9 epv基因突变后游动性与野生型无显著性差异  81-82
      2.10 epv基因与生物膜的形成无关  82-83
      2.12 epv基因突变后在水稻叶片内的繁殖能力无影响  83-84
      2.13 荧光定量PCR结果分析  84-87
    3 讨论与结论  87-89
      3.1 epv基因与水稻细菌性条斑病菌致病性相关,但不影响过敏性反应  88
      3.2 epv基因与胞外多糖的产生相关  88
      3.3 epv基因受DSF信号分子的群体感应系统和全局调控因子Clp的正向调控  88-89
攻读硕士学位期间发表的论文  89-91
参考文献  91-101
致谢  101

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