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利用RNAi介导抗BYDV和WDV小麦新种质的研究

作　者: 庞俊兰
导　师: 王锡锋
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 大麦黄矮病毒 小麦矮缩病毒 双价干涉载体 小麦遗传转化 标记基因
分类号: S435.121
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量关系着国家粮食安全和国民经济的发展。由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses，BYDVs)引发的小麦黄矮病，是我国小麦种植区最重要的小麦病毒病害之一，同时也是世界上危害最严重、流行最广泛的植物病毒病害之一。该病毒流行年份一般会造成20％～30％的减产，严重时达50％以上，甚至颗粒无收，被称为小麦的“黄色瘟疫”和“癌症”。由小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus，WDV）引发的小麦矮缩病在欧洲、北非、亚洲和大洋洲造成了严重的经济损失，特别是在欧洲该病害造成小麦减产40%～80%。2007年本实验室在国内首次报道了小麦矮缩病的发生，随后该病害在陕西、甘肃、河北、云南等12个省陆续被报道发现，尤其在陕西北部麦区已经引起小麦严重的减产，成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病害。防治与控制病毒病最为经济有效的方法是利用品种自身的抗性从而达到主动防治病害的目的，然而利用传统的育种方式很难获得兼抗两种病毒病和高产、优质品种。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是指由双链RNA的介导，特异性靶标对应序列的mRNA，从而抑制相应基因表达的一种基因表达与调控方式，也是寄主一种重要防御病毒病侵害的机制。当表达来源于病毒某一基因序列的转基因植物发生RNAi时，就能使入侵的同一病毒或同属中相近病毒的RNA降解，从而赋予转基因植物对病毒的抗性。因此利用RNAi获得抗BYDVs和WDV小麦种质，成为解决这两种病害的有效途径。随着转基因植物研究的深入和转基因作物的大范围种植，转基因生物安全性评价标准也在不断提高，人们期望获得无筛选标记基因和其他载体骨架的转基因新种质，这也成为目前转基因植物研究的热点之一。本研究针对BYDV-GAV和WDV的CP基因的高保守性，构建了RNAi植物表达载体和最小表达框，期望利用基因枪介导的遗传转化和最小表达框技术，筛选获得高抗或免疫的小麦种质。为最终实现利用RNAi获得抗BYDVs和WDV小麦新品种的预期目标提供抗病新种质。主要结果如下：1.表达载体的构建。成功的构建成了适用于小麦基因枪转化的载体：双价表达载体有pMCG161+/-BW、pMCG161+BW、pMCG161-BW；pWMB006+/-HBW、pWMB006+HBW、pWMB006-HBW。单价表达载体有pMCG161+/-W、pMCG161+W、pMCG161-W。另外通过酶切获得+/-HBW最小表达框。2.基因枪转化小麦及转化后代的分子检测。将构建好的载体和最小表达框利用基因枪法转化小麦幼胚幼胚愈伤组织，经过筛选和抗性愈伤的分化得到再生植株，再通过PCR检测获得了pMCG161+/-BW阳性植株36株，pMCG161+BW和pMCG161-BW均获得5株；pWMB006+/-HBW获得20株，pWMB006+HBW和pWMB006-HBW均获得5株；pMCG161+/-W获得10株，pMCG161+W和pMCG161-W均获得4株；转最小表达框的获得11株。平均转化率是1.2%，最高转化率是2.0%。Southen Blotting结果显示：在T3代稳定遗传的3个转基因株系中外源基因已经成功整合到小麦基因组染色体上，拷贝数为1-3个。对T3代稳定遗传的转基因株系中取8个株系，进行了实时荧光定量PCR检测，结果表明：转基因植株中目的基因的表达量低于受体材料，pMCG161+/-BW的一个株系P7-5-2相对基因表达量为0.3；P11-1-3的相对基因表达量为0.24；转pWMB006+/-HBW载体植株6个株系中5个株系的目的基因干扰效果很明显，其相对基因表达量0.15。3．转基因植株的抗病鉴定。对稳定遗传的株系在T3代和T4代植株进行了BYDV-GAV的抗病性鉴定，获得了免疫株系有：14个转干扰载体pMCG161+/-BW的株系，9个独立转化事件；5个转干扰载体pWMB006+/-HBW的株系，5个独立转化事件；后者有望筛选到无标记基因的转基因抗病种质，为抗病育种提供新材料。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章 文献综述  15-34
  1.1 小麦黄矮病的研究进展  15-19
    1.1.1 小麦黄矮病的发生及危害  15-16
    1.1.2 小麦黄矮病的病原及其特征  16
    1.1.3 大麦黄矮病毒的分类地位及株系划分  16-17
    1.1.4 大麦黄矮病毒传播特性和发病症状  17-18
    1.1.5 大麦黄矮病毒基因组结构及功能  18
    1.1.6 小麦黄矮病的防治策略  18-19
  1.2 小麦矮缩病的研究概况  19-22
    1.2.1 小麦矮缩病的发生及危害  19-20
    1.2.2 小麦矮缩病的病原及其特征  20
    1.2.3 小麦矮缩病毒传播特性和发病症状  20-21
    1.2.4 小麦矮缩病毒基因组结构及功能  21
    1.2.5 小麦矮缩病的防治策略  21-22
  1.3 小麦基因工程研究进展  22-29
    1.3.1 转基因植物国内外发展概况  22
    1.3.2 小麦基因工程研究进展  22-25
    1.3.3 RNAi 的发现  25
    1.3.4 RNAi 的作用机制  25
    1.3.5 RNAi 的特点  25-26
    1.3.6 外源基因沉默策略  26-28
    1.3.7 RNAi 在小麦抗病毒基因工程中的重要性  28-29
  1.4 小麦转基因主要方法概述  29-31
    1.4.1 农杆菌介导法  29-30
    1.4.2 小麦花粉管通道法  30
    1.4.3 小麦基因枪法  30-31
    1.4.4 小麦主要转基因方法的比较  31
  1.5 无筛选标记及骨架序列转基因小麦培育  31-33
    1.5.1 标记基因的安全性问题  31-32
    1.5.2 获得无标记转基因植株技术  32
    1.5.3 基因枪介导的最小表达框转化技术  32
    1.5.4 基因枪介导的共转化技术  32-33
  1.6 研究目的与意义  33-34
第二章 适合基因枪转化的 RNA 干扰载体的构建  34-48
  2.1 材料与方法  34-38
    2.1.1 病毒分离物  34
    2.1.2 质粒和菌株  34
    2.1.3 酶及实验试剂酶及实验试剂：  34
    2.1.4 小麦叶组织总 RNA 的提取  34-35
    2.1.5 引物设计  35
    2.1.6 反转录 PCR（RT-PCR）  35-36
    2.1.7 PCR 产物的回收、连接及转化感受态细胞  36-37
    2.1.8 序列的测定及分析  37
    2.1.9 正向片段与载体 pMCG161 的连接转化  37-38
    2.1.10 反向片段与载体 pMCG161 的连接转化  38
  2.2 结果与分析  38-46
    2.2.1 BYDV-GAV CP 全长基因的克隆、测序  38
    2.2.2 BYDV-GAV CP 基因的部分片段克隆、测序  38-39
    2.2.3 WDV-CP 全长基因的克隆、测序  39
    2.2.4 WDV-CP 部分片段克隆、测序  39-40
    2.2.5 BYDV-WDV-CP 串连基因（简写为 BW-CP 基因）的连接、测序  40
    2.2.6 BYDV-WDV-HCP 串连基因（简写为 HBW-CP 基因）的连接、测序  40-41
    2.2.7 pMCG161+/-W 单价干涉载体的构建  41-42
    2.2.8 pMCG161+/-BW 双价干涉载体的构建  42-44
    2.2.9 pWMB006+/-HBW 双价干涉载体的构建  44-46
    2.2.10 +/-HBW 最小表达框的构建：  46
  2.3 讨论  46-48
第三章 利用基因枪法对小麦品种进行遗传转化  48-56
  3.1 材料与方法  48-52
    3.1.1 小麦品种  48
    3.1.2 小麦遗传转化用到的培养基：  48-50
    3.1.3 准备靶材料  50-51
    3.1.4 利用基因枪法转化小麦受体  51
    3.1.5 小麦遗传转化体的筛选和植株的再生  51-52
  3.2 结果与分析  52-54
    3.2.1 小麦基因枪转化小麦幼胚获得转基因植株的流程图  53-54
    3.2.2 基因枪转化转基因植株完成情况  54
  3.3 讨论  54-56
第四章 转基因小麦后代植株的分子检测  56-67
  4.1 材料与方法  56-60
    4.1.1 材料  56
    4.1.2 转基因小麦植株叶片的 DNA 提取  56-58
    4.1.3 外源基因的 PCR 检测  58
    4.1.4 小麦基因组 DNA 的 Southen 杂交  58-59
    4.1.5 转基因小麦植株叶片的 RNA 提取  59
    4.1.6 实时荧光定量 PCR 检测  59-60
  4.2 结果与分析  60-66
    4.2.1 转化 pMCG161+/-BW 干扰载体小麦植株 PCR 检测  60-61
    4.2.2 转化 pMCG161+/-W 干扰载体的小麦植株的 PCR 检测  61-62
    4.2.3 转 pWMB006HBW-CP 干扰载体的小麦植株的 PCR 检测  62
    4.2.4 转+/-HBW 最小表达框的 PCR 检测  62-63
    4.2.5 转基因小麦植株的基因组 DNA 的 Southe blotting 检测  63
    4.2.6 转基因植株的 Q-RT-PCR 分析  63-64
    4.2.7 转基因小麦分子检测结果和转化率  64-66
  4.3 讨论  66-67
第五章 转基因小麦植株的抗病性鉴定  67-71
  5.1 材料与方法  67-68
    5.1.1 研究材料  67
    5.1.2 接种  67
    5.1.3 接种后的发病级别调查  67-68
  5.2 结果与分析  68-70
    5.2.1 BYDV-GAV 抗性植株的鉴定  68-70
    5.2.2 WDV-CP 抗性植株的鉴定  70
  5.3 讨论  70-71
第六章 全文结论  71-72
参考文献  72-84
附录  84-90
致谢  90-92
作者简介  92-93

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 麦类病虫害 > 病害
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