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稻曲病菌T-DNA插入突变体A880-1、B1015侧翼相关基因的克隆及功能分析

作　者: 胡建坤
导　师: 刘永锋；何健
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 稻曲病菌 启动子 生长相关基因 生物学特性 克隆
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究基于启动子捕获技术,运用农杆菌介导转化法(AtMT)构建稻曲病菌突变体库,获得T-DNA插入突变体9800余株。其中A库中突变体个数为5600余株,其野生菌株为70-22；B库中突变体个数为4200余株,其野生菌株为P1。通过荧光显微观察,筛选获得T-DNA插入在稻曲病菌启动子下游区域的突变体10株。其中A库6株,分别为A880、A2000、A2331、A4829、A5248和A5297；B库4株,分别为B111、B367、B913和B4865。在这10株突变体的生长速率测定试验中,A880的纯化菌株A880-1和野生菌株70-22相比,在马铃薯蔗糖固体培养基(PSA)、TB3固体培养基和基本培养基(MM)中生长速率均变慢；在MM培养基中,A880-1中出现畸形菌丝,且在这些菌丝末端有大量的薄壁分生孢子长出,因此突变体A880-1用来做进一步的研究。在荧光显微镜下观察发现,突变体A880-1的菌丝与孢子都能被激发产生绿色荧光。利用聚合酶链式反应(PCR)技术证实了T-DNA插入在A880-1基因组中。经过Southern杂交分析证实了T-DNA在A880-1基因组中为单拷贝插入。运用高效的热不对称交错PCR (hi-TAIL PCR)技术,克隆获得了T-DNA上gfp5’端上游,A880-1基因组DNA中2038bp大小的启动子序列,并将该启动子命名为puv880。将puv880在NCBI网站上进行比对,未发现存在同源性的序列。经过分析在puv880中找到启动子的核心元件TATA-box、CAAT-box以及几个其他可能的真核生物调控元件。同时在puv880发现三个类似于TATA-box的结构以及一个TATA-box的反向互补序列。依据5’缺失分析方法,选取puv880上靠近gfp一端长度分别为444bp、650bp、864bp和1045bp长的四段序列,和A880-1基因组中T-DNA一起扩增,然后将这四个片段在PEG的介导下转化到稻瘟病菌野生菌Guy11基因组中,结果表明所有的四个片段都表现出启动子活性。该实验结果证实了prv880的启动功能,同时证实puv880的核心启动子序列不超过444bp。结合生长速率测定,推测启动子puv880与稻曲病菌在不利环境下的生长与产孢有关,对解析稻曲病菌形成薄壁分生孢子的分子机理提供了重要线索。通过致病性试验,还获得一个稻曲病菌致病性丧失突变体B1015。与野生菌株P1相比,B1015在PSA、TB3及MM培养上生长速率明显变慢,在马铃薯蔗糖液体培养基(PS)上几乎没有生长,且没有分生孢子的产生,推测T-DNA的插入影响了稻曲病菌生长相关基因的功能。利用PCR技术证实了T-DNA插入在B1015的基因组中。经过Southern杂交分析证实T-DNA在B1015基因组中为单拷贝插入。采用hi-TAIL PCR技术得到了T-DNA侧翼两端稻曲病菌突变体B1015上各247bp(U.vRB)和309bp(U.vLB)长的序列。依据U.vRB和U.vLB序列设计引物F1、R1,以突变体B1015基因组DNA为模板扩增后经测序发现T-DNA中gfp基因及其终止子的大部分序列丢失,推测T-DNA的插入导致了B1015中T-DNA部分序列的丢失。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
上篇 文献综述  11-32
  第一章 水稻稻曲病研究进展  12-20
    1. 稻曲病的概况  12-13
      1.1. 稻曲病的发病症状  12
      1.2. 稻曲病的危害  12-13
      1.3. 稻曲病发病影响因素  13
    2. 稻曲病的病原菌  13-16
      2.1. 厚垣孢子  14
      2.2. 分生孢子  14
      2.3. 菌核、子囊和子囊孢子  14-15
      2.4. 稻曲病菌的侵染  15
      2.5. 培养条件  15-16
    3. 稻曲病的防治  16-18
      3.1. 农业防治  16
      3.2. 化学防治  16-17
      3.3. 生物防治  17-18
    4. 稻曲病菌的分子致病机理研究  18-20
  第二章 启动子的研究进展  20-30
    1. 启动子的概念  20
    2. 启动子中常见的保守元件  20-22
      2.1. 转录起始位点(initiator,Inr)  21
      2.2. TATA-box  21
      2.3. CAAT-box  21-22
      2.4. GC-box  22
      2.5. 增强子和沉默子  22
    3. 启动子的克隆的方法  22-27
      3.1. 基于生物信息学的启动子的预测技术  22-23
      3.2. 基于PCR技术的启动子的克隆  23-25
      3.3. 启动子捕获技术  25-27
    4. 启动子的功能分析方法  27-30
      4.1. 生物信息学方法  27
      4.2. 点突变分析  27
      4.3. 缺失分析  27-28
      4.4. 凝胶阻滞试验  28
      4.5. 酵母单杂交实验  28-30
  第三章 本研究选题依据及意义  30-32
下篇 研究内容  32-69
  第一章 稻曲病菌突变体库的构建及突变体的筛选  33-39
    摘要  33
    ABSTRACT  33-34
    1. 材料和方法  34-36
      1.1. 材料  34
      1.2. 农杆菌介导的转化  34-35
      1.3. T-DNA插入在启动子下游区域的突变体的筛选  35
      1.4. 突变体的纯化  35
      1.5. 突变体的致病性及生物学特性的初步分析  35-36
    2. 实验结果  36-39
      2.1. 稻曲病菌突变体库的构建  36
      2.2. T-DNA插入在启动子下游区域突变体的筛选  36-37
      2.3. 纯化及保存  37
      2.4. 10株突变体的致病性测定及生物学特性的初步分析  37-39
  第二章 T-DNA插入启动子下游区域突变体A880-1的生物学特性及其启动子的克隆及功能分析  39-59
    摘要  39
    ABSTRACT  39-41
    1. 材料和方法  41-50
      1.1. 材料  41
      1.2. 突变体A880-1的生物学特性分析  41
      1.3. A880-1中T-DNA的分子检测  41-45
      1.4. A880-1中T-DNA侧翼启动子的克隆  45-49
      1.5. A880-1中启动子序列的分析  49
      1.6. A880-1中T-DNA侧翼启动子的功能验证  49-50
    2. 结果和分析  50-57
      2.1. A880-1的生物学特性分析  50-52
      2.2. A880-1中T-DNA的分子检测  52-54
      2.3. A880-1中T-DNA侧翼启动子的克隆  54-55
      2.4. Puv880的5’端缺失分析  55-57
    3. 讨论  57-59
  第三章 致病性丧失突变体B1015生物学特性及其T-DNA插入位点侧翼序列的分析  59-69
    摘要  59
    ABSTRACT  59-60
    1. 材料和方法  60-62
      1.1. 材料  60
      1.2. B1015的致病性分析  60
      1.3. B1015的生物学特性分析  60-61
      1.4. B1015中T-DNA的分子鉴定  61
      1.5. B1015中T-DNA侧翼序列的扩增  61-62
    2. 结果与分析  62-67
      2.1. B1015的致病性测定  62-63
      2.2. B1015的生物学特性分析  63-65
      2.3. B1015中T-DNA的分子鉴定  65-66
      2.4. B1015中T-DNA侧翼序列的扩增  66-67
    3. 讨论  67-69
全文总结  69-71
参考文献  71-79
附录 实验中所使用的培养基及试剂的配制方法  79-85
攻读学位期间发表的学术论文  85-86
致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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