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水稻条纹病毒基因NS2致病作用机理分析

作　者: 郑璐平
导　师: 谢联辉
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻条纹病毒 NS2 纤维蛋白柯浩体蛋白双分子荧光互补(BiFC) 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
分类号: S435.111.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水稻条纹叶枯病是水稻的重要病毒病之一，严重危害着我国的水稻生产，其病原为水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)，是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员。近年随着生物技术的发展，对该病毒的研究也日趋深入，特别是两大模式植物即本氏烟和拟南芥被确认为可被RSV侵染后，使得对该病毒的研究可以克服在寄主水稻研究上的诸如水稻培养周期长、转基因植株培育时间久等种种障碍和困难。RSV编码的NS2蛋白是新发现的一个弱基因沉默抑制子，定位在细胞核，能与水稻基因沉默抑制子3(suppressor of gene silencing3, SGS3)互作，SGS3是植物内源基因，相对保守，研究表明拟南芥SGS3突变体表现出强感病性，但目前对NS2基因如何致病以及OsSGS3基因是否具有抗病性还未被深入研究。因此，本文利用病毒诱导基因沉默技术(Virus inducing gene silencing, VIGS)，在本氏烟上对NS2基因的致病性和OsSGS3基因的抗病性进行分析；同时构建了OsSGS3-RNAi转基因水稻，为研究其在RSV的抗病调控功能打下基础。本文研究内容主要分为三部分。第一部分，通过共定位方法进一步确定NS2在细胞核内的具体位置，并通过双荧光互补实验(Bimolecular fluorescencecomplementation, BiFC)确定NS2与三种寄主即拟南芥、本氏烟和水稻的核仁和柯浩体的互作情况；第二部分，利用VIGS技术分别沉默基因NbFib2和NS2后，通过RSV摩擦接种沉默植株，研究这两者在RSV侵染过程中的作用；第三部分，利用VIGS技术沉默与OsSGS3同源的本氏烟NbSGS3，通过RSV摩擦接种沉默植株，检视SGS3对RSV是否具有抗病性，并根据研究结果，进一步构建OsSGS3干扰的转基因水稻。获得如下结果：1发现NS2的亚细胞定位存在周期性变化，先定位在细胞核后运动到细胞核外；明确了NS2在细胞核内的具体定位及其与三种寄主的核仁和cajal body蛋白的互作情况。通过共定位观察发现NS2可以定位在柯浩体和核仁上，BiFC结果显示NS2可以与三种寄主编码的3个核仁和柯浩体指示蛋白即Atcoilin、NbFib2和OsFib2互作。2明确了NS2和NbFib2在RSV侵染中的作用。RSV分别接种沉默了NS2和NbFib2的本氏烟，在沉默植株的接种叶中可以检测到病毒，而在非接种叶中检测不到病毒；病毒在沉默植株接种叶的积累量比对照即VIGS (空)植株低，这说明这两个基因影响了病毒的复制及系统侵染。在NbFib2沉默的本氏烟中，NS2早期的亚细胞定位发生了改变，与对照即健康植株或VIGS (空)接种植株相比，NS2形成的小颗粒不仅定位在细胞核，还分布在其它细胞器中。可见，RSV在进行系统侵染需要NS2和Fib2的参与，而NS2借助Fib2进入细胞核可能是RSV侵染和复制所需要的。3发现沉默了与OsSGS3同源的NbSGS3的本氏烟植株，经RSV接种后，在发病时间和发病程度上均表现出对RSV感病性，根据这一结果利用RNA干扰技术构建并获得OsSGS3干扰的转基因水稻T0代，为进一步研究OsSGS3基因的抗病调控功能奠定基础。

全文目录

目录  5-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-30
  1.1 水稻条纹叶枯病的发生现状  12-15
    1.1.1 病害的发生与流行  12-13
    1.1.2 病害的症状与危害  13-14
    1.1.3 病害的病原与特征  14
    1.1.4 病原物的寄主范围与传毒特性  14-15
  1.2 水稻条纹病毒分子的研究现状  15-22
    1.2.1 RSV 的基因组结构  15-16
    1.2.2 RSV 编码的蛋白与蛋白功能  16-20
    1.2.3 RSV 的致病性与分子变异  20-22
  1.3 核仁蛋白 Fibrillarin 与柯浩体蛋白 coilin 的研究现状  22-24
    1.3.1 Fibrillarin 的研究进展  22-23
    1.3.2 coilin 的研究进展  23-24
  1.4 本文涉及的关键技术体系  24-27
    1.4.1 双分子荧光互补技术  24-26
    1.4.2 病毒诱导的基因沉默技术  26-27
  1.5 本研究的目的和意义  27-30
2 NS2 与核仁纤维蛋白、柯浩体蛋白的互作  30-56
  2.1 材料和方法  31-40
    2.1.1 材料  31-32
    2.1.2 方法  32-40
  2.2 结果与分析  40-53
    2.2.1 RSV-NS2、Atcoilin、NbFib2、OsFib2 的克隆  40
    2.2.2 入门重组载体的构建  40-42
    2.2.3 重组植物表达载体及 BiFC 载体的构建  42-43
    2.2.4 重组蛋白在本氏烟叶片中的表达  43-45
    2.2.5 NS2 的亚细胞定位  45-46
    2.2.6 NS2 与核仁纤维蛋白、柯浩体蛋白的共定位  46-50
    2.2.7 NS2 与核仁纤维蛋白、柯浩体蛋白的互作  50-53
  2.3 小结与讨论  53-56
3 NS2 与 NbFib2 在 RSV 侵染中的作用  56-82
  3.1 材料和方法  57-64
    3.1.1 材料  57-58
    3.1.2 方法  58-64
  3.2 结果与分析  64-80
    3.2.1 VIGS 载体的构建  64-65
    3.2.2 不同基因沉默处理对本氏烟生长发育的影响  65-67
    3.2.3 病毒诱导基因沉默的 RT-PCR 检测  67-68
    3.2.4 VIGS 靶基因在植株中的表达量分析  68-73
    3.2.5 RSV 接种沉默植株  73-75
    3.2.6 植株体中 RSV 的病毒积累量  75-76
    3.2.7 PVX、TMV 侵染 Fib2 基因沉默植株  76-78
    3.2.8 NS2 在 Fib2 基因沉默植株的亚细胞定位  78-80
  3.3 小结与讨论  80-82
4 SGS3 基因抗病性初步分析  82-104
  4.1 材料和方法  84-90
    4.1.1 材料  84-85
    4.1.2 方法  85-90
  4.2 结果与分析  90-101
    4.2.1 本氏烟 SGS3 和水稻 SGS3 蛋白序列比对  90-91
    4.2.2 VIGS 载体构建  91-92
    4.2.3 沉默植株中靶基因表达量检测  92-93
    4.2.4 RSV 侵染 SGS3 基因沉默本氏烟  93-95
    4.2.5 RSV 在植株体内的积累  95
    4.2.6 植物表达载体的构建  95-97
    4.2.7 SGS3 (1+2) RNAi 转基因植株的获得  97-99
    4.2.8 T0代转基因植株的检测  99-101
  4.3 小结与讨论  101-104
5 全文总结  104-106
参考文献  106-122
附录  122-132
致谢  132

水稻条纹病毒基因NS2致病作用机理分析

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