学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

豚鼠动脉粥样硬化模型的建立及机理探讨

作　者: 陈慧敏
导　师: 高南南
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生药学
关键词: 动脉粥样硬化豚鼠 CETP LCAT PPARα LDL-R SR-BI CD36 Ox-LDL ABCA1
分类号: R543
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 225次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

背景动脉粥样硬化及其并发症严重危害人类健康。动脉粥样硬化的发病机制复杂,是多种因素长期共同作用的结果。探明动脉粥样硬化发病机理、筛选研究有效治疗药物是国内外研究的重点和难点,而建立一种与人类动脉粥样硬化发病机制、临床表现相一致或接近的整体动物模型则是进行上述研究的关键。近年来,国内外学者使用鸟类、鼠类、兔、猪、非人灵长类动物和转基因动物等用于实验性动脉粥样硬化的研究,在取得诸多进展的同时,也逐步发现模型的缺陷和不足,限制了其应用。研究资料提示,豚鼠是极少数通过LDL携带和转运大部分胆固醇的动物之一,这点与人类极为相似。其次,豚鼠血浆脂质构成、胆固醇和脂蛋白代谢方式上也与人类存在诸多相似之处,对药物治疗的反应性与临床研究结果一致。提示将豚鼠作为由脂代谢紊乱造成的动脉粥样硬化的动物模型,可能具有一定的优势。目的探索建立豚鼠动脉粥样硬化模型的方法,使模型具有典型的动脉粥样硬化病变特征。从整体、细胞和分子水平探讨豚鼠动脉粥样硬化的发病机制,并与另一种啮齿类动物大鼠模型进行平行比较,阐明豚鼠作为一种新型动脉粥样硬化动物模型的特点及优势所在。方法将豚鼠和大鼠分别随机分为正常、模型组1组和模型2组。正常对照组饲常规饲料,模型1组饲含0.5%胆固醇、10%猪油的高脂饲料,模型2组饲含1%胆固醇、10%猪油的高脂饲料,连续10周的方法建立动脉粥样硬化模型。观测动物体重、摄食量和状态变化。诱导结束后首先检测血清脂质和肝脏脂质的变化；酶联免疫吸附法测定血清CETP、LCAT、hs-CRP和Ox-LDL浓度；取主动脉弓至胸主动脉下端进行苏Ⅳ染色,观察主动脉壁内脂质沉积、动脉粥样硬化病灶面积百分比；取主动脉根部至主动脉弓部的动脉进行石蜡切片,Masson染色法观察动脉内膜胶原纤维的变化,HE染色法分析内膜面积／中膜面积、内膜炎性细胞浸润和内膜表层斑块的形成情况；免疫组化检测血管内膜ABCA1、CD36、ICAM-1蛋白表达的变化；实时荧光定量法检测肝脏PPARa、LCAT、LDL-R、SR-BI mRNA相对表达的变化,对豚鼠SR-BI基因进行克隆测序。结果1.血脂和肝脂的变化高脂饲料诱导10周后,与正常组相比,豚鼠两个模型组血浆TC、TG、LDL-C水平均显著升高,形成了典型的高脂血症。而大鼠只有模型1组LDL-C和模型2组TC、LDL-C出现显著升高,且升高幅度明显低于相同条件诱导的豚鼠。豚鼠和大鼠各模型组肝脏TC和TG均显著性升高,且升高幅度近似。豚鼠模型1组和模型2组的血清HDL-C水平显著升高了9.9和10.8倍,HDL的两个主要亚型HDL3/ HDL2比值也都显著升高,HDL组成和分布发生变化,小颗粒的HDL3堆积。大鼠两个模型组的血清HDL-C水平和HDL3/ HDL2比值与正常组相比都未发生变化。2.动脉粥样硬化病变正常豚鼠和大鼠主动脉壁光滑、平坦,内皮细胞完整、连接紧密、紧贴于平直的内弹力板上,平滑肌细胞呈长梭形、排列整齐,无炎症细胞聚集,无斑块形成。豚鼠经高脂饲料诱导10周后,主动脉壁大体染色出现斑块(脂质斑块)；高倍镜下观察(×400),内膜明显增厚(表现为大量单核／巨噬细胞来源的泡沫细胞堆积于内膜表层)；内膜单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润与聚集增加,大量的泡沫细胞聚集形成斑块；泡沫细胞内富含脂质,细胞外形成脂滴,破坏内膜平滑肌细胞之间的正常连接,使平滑肌细胞被这些脂质包绕分割。少数病变严重的豚鼠主动脉出现细胞外脂质融合和纤维帽,形成纤维斑块。但病灶内未发现明显组织坏死、钙化、斑块破裂出血和血栓形成。按AHA的动脉粥样硬化分期标准,豚鼠模型组形成了Ⅱ-Va型动脉粥样硬化病变,介于动脉粥样硬化的早期和晚期之间。对豚鼠动脉粥样硬化病理变化进行半定量分析,模型1和模型2组斑块的发生率分别为70%(7／10)和75%(6／8),主动脉斑块面积%、纤维面积%、内膜面积%,内膜面积／中膜面积比值较正常对照组都明显升高。而相同条件诱导下大鼠动脉管壁未形成明显的动脉粥样硬化病变,半定量分析也无显著变化。3.分子机制研究与正常组相比,豚鼠模型组肝脏LDL-R mRNA表达下调,血浆Ox-LDL水平显著升高,说明豚鼠正常的LDL-C受体代谢途径受阻,大量LDL被氧化修饰成Ox-LDL。同时豚鼠模型组主动脉CD36蛋白表达上调,说明大量的Ox-LDL经巨噬细胞膜CD36受体摄入细胞内,形成泡沫细胞。豚鼠模型组血浆CETP水平显著升高,一方面促进小而致密的LDL形成并沉积于动脉,另一方面促进小颗粒HDL3水平相对升高。此外,豚鼠模型组血浆LCAT水平和肝脏LCAT mRNA表达都显著下降,表明LCAT催化HDL3向HDL2的酯化转变减少,HDL成熟过程受阻,也是HDL3/HDL2比值升高的原因之一。豚鼠摄入高脂饮食后,主动脉粘附分子ICAM-1蛋白表达增加,促进了炎性细胞的粘附与聚集；血浆hs-CRP水平升高,提示豚鼠出现血管炎症反应,促进了粥样硬化的发生发展。而相同高脂饮食诱导的大鼠只有模型2组血浆Ox-LDL、hs-CRP水平和主动脉CD36蛋白表达升高,且变化幅度不如豚鼠明显。此外,高脂饮食的摄入导致豚鼠两个模型组肝脏SR-BI mRNA和主动脉ABCA1蛋白表达代偿性升高,而大鼠未出现此变化。结论1.采用0.5%胆固醇和10%猪油的高脂膳食诱导豚鼠10周可建立典型的动脉粥样硬化模型。2.与大鼠相比较,豚鼠对饮食性胆固醇更敏感,通过高脂饮食诱导更易于形成动脉粥样硬化病变。3.豚鼠容易形成动脉粥样硬化病变的原因和机制与血浆脂蛋白的代谢、动脉粥样硬化形成过程中关键酶、蛋白、细胞因子和受体(包括CETP、LCAT、CD36、LDL-R、Ox-LDL、ICAM-1等)的变化有关。4.此法建立的豚鼠动脉粥样硬化模型具有造模周期较短、指标稳定、操作简便、具有典型动脉粥样硬化病变特征的特点,为脂代谢紊乱及动脉粥样硬化治疗药物筛选和评价提供了一种较为合适的动物模型。

全文目录

目录  3-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-21
  1.动脉粥样硬化及其相关的心脑血管疾病严重危害人类健康  15
  2.动脉粥样硬化发生是一个多因素作用的复杂病理过程  15-18
    2.1 动脉粥样硬化的病理特征  15-16
    2.2 动脉粥样硬化发病机制的多种学说  16-18
      2.2.1 脂质代谢紊乱学说  16
      2.2.2 内皮损伤学说  16-17
      2.2.3 炎症反应学说  17
      2.2.4 动脉粥样硬化是一个多因素作用的复杂病变过程  17-18
  3.动脉粥样硬化动物模型的现状及存在的问题  18
  4.豚鼠脂代谢的生理特点和病理特征  18-21
实验材料  21-25
  1.实验动物  21
  2.饲料  21
  3.试剂及配置  21-24
    3.1 主要试剂  21-23
    3.2 主要试剂配制  23-24
  4.主要仪器设备  24-25
实验方法  25-38
  1.动物分组及模型建立  25
  2.观察和检测指标  25-38
    2.1 一般观察  25
    2.2 脂质测定  25-26
      2.2.1 血清脂质测定  25
      2.2.2 肝脏脂质测定  25-26
    2.3 酶联免疫吸附法测定血清CETP、LCAT、HDL_2、HDL_3、hs-CRP、Ox-LDL水平  26
    2.4 实时荧光定量PCR检测  26-30
      2.4.1 目的基因的选择  26-27
      2.4.2 实验试剂和耗材处理  27
      2.4.3 肝脏RNA提取  27
      2.4.4 RNA纯度、浓度检测  27-28
      2.4.5 目的基因引物的设计与合成  28
      2.4.6 逆转录PCR(RT-PCR)  28-29
      2.4.7 Real-Time PCR  29-30
      2.4.8 标准曲线的制作  30
      2.4.9 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物  30
    2.5 豚鼠SR-BI基因表达片段的克隆测序  30-32
      2.5.1 PCR产物回收纯化  30-31
      2.5.2 SR-BI基因与pUCm-T Vector的连接  31-32
      2.5.3 转化  32
      2.5.4 筛选  32
      2.5.5 豚鼠SR-BI基因序列分析  32
    2.6 动脉粥样硬化病理形态学观察  32-36
      2.6.1 动脉标本取材  32
      2.6.2 石蜡包埋切片制作法  32-33
      2.6.3 苏木素—伊红(HE)染色及结果判定  33-35
      2.6.4 Masson染色  35
      2.6.5 苏丹IV染色  35-36
      2.6.6 动脉粥样硬化分期  36
    2.7 免疫组化  36-38
      2.7.1 免疫组化操作过程  36-37
      2.7.2 免疫组化切片观察和结果分析  37-38
实验结果  38-57
  1.一般观察  38-39
  2.血清脂质变化  39-41
    2.1 血清TC  39
    2.2 血清TG  39
    2.3 血清LDL-C  39
    2.4 血浆脂蛋白组成  39
    2.5 血清HDL-C、HDL_3/HDL_2比值  39-41
  3.肝脏脂质的变化  41-43
  4.血清CETP、LCAT、OX-LDL、HS-CRP含量变化  43-45
    4.1 血清CETP  43
    4.2 血清LCAT  43
    4.3 血清Ox-LDL  43-44
    4.4 血清hs-CRP  44-45
  5.主动脉病理形态学变化  45-49
    5.1 主动脉动脉粥样斑块苏丹IV染色  45-46
    5.2 HE染色结果  46-48
    5.3 Masson染色结果(主动脉纤维增生面积比变化)  48-49
  6.主动脉ICAM-1、CD36和ABCA1蛋白表达变化  49-53
    6.1 主动脉ICAM-1蛋白表达  49
    6.2 主动脉CD36蛋白表达  49-50
    6.3 主动脉ABCA1蛋白表达  50-53
  7.肝脏LCAT、LDL-R、PPARA和SR-BI MRNA表达变化  53-57
    7.1 PCR扩增特异性  53-54
    7.2 肝脏LCAT、LDL-R、PPARα、SR-BI基因表达变化  54-56
    7.3 豚鼠SR-BI序列分析  56-57
讨论  57-71
  1.脂代谢紊乱  57
  2.动脉粥样硬化病变形成  57-58
  3.LDL-C代谢异常促进AS形成  58-62
    3.1 高血浆LDL-C/HDL-C比值  58
    3.2 CETP活性增高促进动脉粥样硬化形成  58-59
    3.3 高Ox-LDL浓度促进泡沫细胞形成  59-60
    3.4 CD36介导的Ox-LDL吞噬作用增强  60-61
    3.5 正常的LDL-C代谢途径受阻  61-62
  4.HDL亚型的变化促进动脉粥样硬化发生  62-66
    4.1 HDL_3/HDL_2比值升高  62-63
    4.2 LCAT表达下降抑制HDL成熟  63
    4.3 CETP促进小颗粒HDL_3增多  63-64
    4.4 高脂饮食引起豚鼠血浆HDL-C、肝脏SR-BI和动脉ABCA1表达代偿性升高  64-66
  5.炎性因子表达促进动脉粥样硬化形成  66-67
    5.1 粘附分子表达增加和促进炎性细胞聚集  66-67
    5.2 hs-CRP预测动脉粥样硬化的发生  67
  6.PPARA参与调节动脉粥样硬化的发生发展  67-68
  7.SR-BI克隆的意义  68-69
  8.豚鼠动脉粥样硬化模型的优点  69-70
  9.本研究的不足及进一步设想  70-71
结论  71-72
参考文献  72-81
REVIEW  81-95
附录一  95-97
致谢  97

豚鼠动脉粥样硬化模型的建立及机理探讨

内容摘要

全文目录

相似论文