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定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究

作　者: 邓旭衡
导　师: 高年发
学　校: 天津科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 丙酮酸基因敲除酿酒酵母代谢工程丙酮酸脱羧酶
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

丙酮酸是生物细胞内EMP循环中的中间产物,不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用,而且是多种有用物质的前体。因此,它在化工、农药和农用化学品等工业及学科研究中有着广泛的用途。目前丙酮酸生产使用的大部分为光滑球拟酵母,多为硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸四种维生素营养缺陷型。该菌为条件致病菌,存在潜在的安全威胁,而通用来生产酒精的酿酒酵母耐性较强且公认为安全菌,因此本论文以酿酒酵母为研究对象,选育能积累丙酮酸的菌株。首先,以Saccharomyces cerevisiae Y2为出发菌株,把pdcl基因敲除片段(P1K)用电穿孔转化法转化到出发菌株S. cerevisiae Y2中,在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子,通过PCR和southern blot验证得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiaeY2-1。然后,把pdc5基因敲除菌株敲除片段(P5H)用醋酸锂转化法转入到S. cerevisiaeY2-1中,在YNBG平板上筛选转化子,通过PCR和southern blot验证得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。最后,对其S. cerevisiae Y2-15的种子培养基、发酵培养基和发酵条件进行了优化。优化后的种子培养基为(g/L)：葡萄糖30,蛋白胨10,酵母粉5,KH2PO41, MgSO4·7H2O0.5,醋酸钠2,玉米浆0.5%,pH5.6。优化后的发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖80,蛋白胨20,酵母粉10,醋酸钠2.5,玉米浆1%,KH2PO41, MgSO4·7H2O0.5,金属离子母液5mL, pH5.6。优化后的发酵条件为：种龄26h、接种量12%,装液量70mL/250mL三角瓶。S. cerevisiae Y2-15优化后的丙酮酸的积累量为24.85g/L比优化前提高168%。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-26
  1.1 丙酮酸简介  9
  1.2 丙酮酸(盐)及其衍生物的应用  9-10
    1.2.1 在化工制药领域  9
    1.2.2 在食品保健领域  9-10
    1.2.3 其他方面的应用  10
  1.3 丙酮酸(盐)的生产方法  10-12
    1.3.1 化学催化合成法  10
    1.3.2 生物催化法  10-11
    1.3.3 微生物发酵法  11-12
  1.4 发酵法生产丙酮酸研究现状及发展趋势  12-14
  1.5 酿酒酵母代谢  14-23
    1.5.1 酿酒酵母  14-15
    1.5.2 酿酒酵母菌株改造  15-16
    1.5.3 酿酒酵母的葡萄糖代谢  16-19
    1.5.4 酿酒酵母的丙酮酸代谢  19-22
    1.5.5 调节丙酮酸代谢节点上的代谢流量  22-23
  1.6 酿酒酵母生产丙酮酸可行性分析  23
  1.7 基因敲除  23-24
  1.8 本课题立题依据及研究内容  24-26
    1.8.1 立题依据  24
    1.8.2 主要研究内容  24-26
2 材料与方法  26-38
  2.1 实验材料  26-30
    2.1.1 菌种和质粒  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 主要仪器和设备  27-28
    2.1.4 培养基和溶液  28-30
  2.2 分析方法  30
    2.2.1 酿酒酵母细胞浓度测定  30
    2.2.2 丙酮酸含量测定  30
    2.2.3 葡萄糖浓度测定  30
  2.3 实验方法  30-38
    2.3.1 酿酒酵母生长曲线的绘制  30
    2.3.2 大肠杆菌质粒提取  30
    2.3.3 质粒NotⅠ酶切  30-31
    2.3.4 酶切片段回收  31
    2.3.5 酿酒酵母的转化  31-32
    2.3.6 酿酒酵母基因组提取  32
    2.3.7 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定  32
    2.3.8 Southern blot  32-33
    2.3.9 引物合成和PCR扩增  33-37
    2.3.10 酿酒酵母的培养方法  37-38
3 结果与讨论  38-61
  3.1 酿酒酵母Y2的pdc1基因的敲除  38-40
    3.1.1 酿酒酵母Y2生长曲线的测定  38
    3.1.2 电击穿孔法转化酿酒酵母Y2  38-39
    3.1.3 酿酒酵母转化子Y2-1的筛选与鉴定  39-40
    3.1.4 转化子遗传稳定性  40
  3.2 酿酒酵母Y2-1的pdc5基因的敲除  40-43
    3.2.1 醋酸锂转化法转化酿酒酵母Y2-1  40-41
    3.2.2 酿酒酵母转化子Y2-15的筛选和验证  41-42
    3.2.3 转化子遗传稳定性  42-43
  3.3 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活力测定  43-44
    3.3.1 蛋白质浓度标准曲线  43-44
    3.3.2 酿酒酵母Y2,Y2-1,和Y2-15丙酮酸脱羧酶活性比较  44
  3.4 Southern blot验证酿酒酵母基因敲除菌株  44-46
    3.4.1 酿酒酵母基因组酶切  44-45
    3.4.2 探针的标记  45
    3.4.3 杂交和检测  45-46
  3.5 酿酒酵母发酵产酸实验  46-49
    3.5.1 丙酮酸测定  46-48
    3.5.2 摇瓶产酸实验  48-49
  3.6 酿酒酵母Y2-15丙酮酸发酵的优化  49-61
    3.6.1 Y2-15生长曲线的绘制  49-50
    3.6.2 种子培养基的优化  50-51
    3.6.3 发酵培养基的优化  51-57
    3.6.4 发酵条件的优化  57-61
4 结论  61-62
5 展望  62-63
6 参考文献  63-70
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  70-71
8 致谢  71

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