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基于苯硼酸的黏附性高分子药物载体研究

作　者: 程翠
导　师: 李朝兴
学　校: 南开大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 苯硼酸多肽蛋白质类药物含糖聚合物生物黏附性生物相容性药物载体
分类号: TQ460.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

多肽、蛋白质类药物因其具有不可替代的生物活性和良好的临床效果发展十分迅猛，胰岛素、干扰素、肝素和生长因子等越来越多的多肽、蛋白质类药物已成为临床应用的首选。因此，生物制药已被列入国家战略性新兴产业，前景十分广阔。但多肽、蛋白质类药物存在易降解、难以跨膜转运和生物利用度低等缺点，成为制约其广泛应用的瓶颈。本文从给药系统的角度出发，以药物载体为突破口，重点解决载体的微型化、功能化、两亲性、黏附性和相容性，以期为多肽、蛋白质类药物提供一种具有良好生物黏附性、能促进其跨膜转运或抑制酶降解的药物载体。一、基于苯硼酸的两亲性含糖共聚物自组装纳米药物载体苯硼酸及其衍生物能与1,2-或1,3-二醇基团以及多醇羟基相互作用，形成带负电荷的共价复合物。而生物的细胞膜上均含有糖脂或糖蛋白等糖基化合物。因此，苯硼酸能与细胞表面上的这些糖类物质结合，产生黏附作用。苯硼酸因其这一特性被广泛用于生物黏附材料备受研究者关注。本文通过可逆加成断裂链转移聚合（RAFT）成功制备了兼有苯硼酸和乳糖基团的两亲性嵌段共聚物聚[(2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)-block-3-丙烯酰胺基苯硼酸]（p(LAMA-b-AAPBA)）；由于苯硼酸和乳糖基元之间的相互作用以及共聚物的两亲性，p(LAMA-b-AAPBA)在水溶液中易于形成粒径为238~403nm的纳米粒子，zeta电势为-17~-22mV；该纳米粒子作为载体可对胰岛素进行有效包埋，其包封率和载药量分别高达84%和11%；体外药物释放结果显示，载药p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子能缓慢释放胰岛素，其释放机制为Fick扩散；通过MTT法测定纳米粒子对CHO和Caco-2细胞的毒性试验表明，p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子的细胞相容性良好，这说明乳糖基团的引入可有效改善苯硼酸基团的细胞毒性以及聚合物的生物相容性；负载FITC荧光标记胰岛素的p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子进行细胞吸收试验发现：由于纳米粒子中苯硼酸基团能与细胞表面的糖类化合物结合，增强了纳米粒子对细胞的黏附能力，p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子能通过细胞内在化作用成功进入到细胞内。因此，该嵌段共聚物纳米粒子有望成为多肽、蛋白质类药物的理想纳米载体，促进药物进行跨膜转运，增强药物吸收。二、苯硼酸和乳糖基元之间共价结合构筑高分子复合纳米载体苯硼酸及其衍生物能与1,2-或1,3-二醇基团以及多醇羟基相互作用，可逆的生成带负电荷的共价复合物。根据这一特性，本研究将均聚物聚(2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)（pLAMA）和聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸)（pAPBA）在水溶液中进行复合，自组装形成pAPBA/pLAMA杂化纳米粒子；该纳米粒子粒径在195~245nm之间，zeta电势为-23~-31mV之间，粒子分散均匀，且具有良好的稳定性；该杂化纳米粒子可通过疏水-亲水等相互作用成功负载胰岛素，包封率和载药量为高达57%和11%；体外释放结果显示，pAPBA/pLAMA杂化纳米粒子在48h时的累计释放量仅为33%，说明该纳米粒子能对胰岛素进行很好的控制释放；MTT法测定细胞活性试验表明，pAPBA/pLAMA纳米粒子对Caco-2细胞相容性良好。由于纳米粒子中含有生物相容性良好的聚糖pLAMA，在低浓度下对细胞增殖具有一定的促进作用；负载FITC荧光标记胰岛素的pAPBA/pLAMA杂化纳米粒子细胞吸收试验发现，由于纳米粒子中的苯硼酸基团能与细胞表面的糖类物质结合，增强了其对Caco-2细胞的黏附能力，致使pAPBA/pLAMA纳米粒子通过细胞内在化作用进入细胞内；负载胰岛素的pAPBA/pLAMA纳米粒子经糖尿病大鼠鼻腔给后，在1~8h的时间区间内，能有效地降低大鼠的血糖水平，且大鼠的相对血糖水平在4h时达到最低值为20.1%。这说明pAPBA/pLAMA纳米粒子作为载体有效增加胰岛素的鼻腔吸收，并且在体内能缓慢释放胰岛素，达到持续降低血糖的效应；pAPBA/pLAMA纳米粒子经鼻腔给药后的鼻粘膜组织切片结果显示，该纳米粒子不会对大鼠鼻粘膜组织诱发炎症反应，说明该纳米粒子对鼻粘膜无刺激作用。上述结果显示，pAPBA/pLAMA纳米粒子有望成为多肽、蛋白质类药物鼻腔给药的载体。三、基于苯硼酸的水凝胶药物载体由于苯硼酸及其衍生物能与二醇、糖类物质相互作用，在特定条件下将苯硼酸聚合物与糖类化合物进行共聚的过程中会发生自交联作用而形成凝胶。本文在不加交联剂的情况下通过RAFT聚合成功制备出p(APBA-b-LAMA)水凝胶；扫描电镜结果显示p(APBA-b-LAMA)水凝胶呈现出大孔网络结构；溶胀度测定结果发现，该水凝胶凝胶10min内就能达到溶胀平衡，溶胀度高达1860%，说明其具有良好的吸水性；将胰岛素作为模型蛋白药物负载到p(APBA-b-LAMA)水凝胶中，进行体外模拟释放，结果发现该类凝胶能缓慢释放胰岛素，其释放机制为Fick扩散；圆二色法测定胰岛素的螺旋结构发现经由p(APBA-b-LAMA)水凝胶释放出的胰岛素的构象保持完整，说明水凝胶并不会对负载的胰岛素的活性造成影响；通过MTT法测试p(APBA-b-LAMA)水凝胶对NIH3T3细胞的增殖性影响，发现NIH3T3细胞的相对增殖率均在90%以上，说明该类凝胶的细胞相容性良好。因此，该纳米粒子不仅有望成为多肽、蛋白质类药物的有效载体，还可作为细胞支架材料。综上所述，通过RAFT聚合方法制备的一系列基于苯硼酸的高分子药物载体，具有良好的生物相容性和生物黏附性，且能对多肽、蛋白质类药物进行保护，解决了多肽、蛋白质类药物给药系统中出现的粘膜透过性差、在体内容易被酶降解，生物利用率低等问题，是促进多肽、蛋白质类药物传递的良好载体。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-11
目录  11-16
符号说明  16-17
第一章绪论  17-33
  第一节高分子材料用于多肽、蛋白质类药物载体的研究概况  17-23
    1.1.1 高分子微球  17-18
    1.1.2 高分子微胶囊  18-19
    1.1.3 高分子脂质体  19-20
    1.1.4 高分子纳米载体  20-22
    1.1.5 高分子水凝胶  22-23
  第二节基于苯硼酸的高分子材料的研究现状  23-26
    1.2.1 基于苯硼酸基团的糖敏感体系  23-25
    1.2.2 基于苯硼酸基团的酶抑制作用  25-26
    1.2.3 含苯硼酸的聚合物作为生物黏附材料  26
  第三节聚糖类物质的研究状况  26-28
    1.3.1 天然多糖  26-27
    1.3.2 人工合成多糖—含糖聚合物  27-28
  第四节活性/可控自由基聚合方法  28-31
    1.4.1 氮氧介导自由基聚合（NMP）  28-29
    1.4.2 原子转移自由基聚合（ATRP）  29
    1.4.3 可逆加成断裂链转移聚合（RAFT）  29-31
  第五节课题的提出  31-33
    1.5.1 研究的目的、意义  31-32
    1.5.2 研究的内容  32-33
第二章基于苯硼酸的含糖共聚物的制备及其作为多肽、蛋白质类药物载体的研究  33-62
  第一节引言  33-34
  第二节材料与方法  34-46
    2.2.1 试剂与仪器  34-35
    2.2.2 2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯（LAMA）的合成  35-37
    2.2.3 3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）的合成  37-38
    2.2.4 合成 RAFT 试剂 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸（CPADB）  38-39
    2.2.5 聚(2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)（pLAMA）的合成  39
    2.2.6 嵌段共聚物聚[(2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)-block-3-丙烯酰胺基苯硼酸]（p(LAMA-b-AAPBA)）的合成  39-40
    2.2.7 嵌段共聚物 p(LAMA-b-AAPBA) 的表征  40-41
    2.2.8 p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子的制备  41
    2.2.9 p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子的表征  41-42
    2.2.10 载药 p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子包封率和载药量的测定  42-44
    2.2.11 体外释放实验以及数学模拟分析释放机制  44
    2.2.12 MTT 法测试 p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子的细胞毒性  44-45
    2.2.13 激光共聚焦观察细胞吸收实验  45-46
  第三节结果与讨论  46-60
    2.3.1 嵌段共聚物 p(LAMA-b-AAPBA) 的表征  46-50
    2.3.2 p(LAMA-b-AAPBA)纳米粒子的表征  50-54
    2.3.3 包封率（EE）与载药量（LC）的测定  54-56
    2.3.4 体外释放及释放机理的初步研究  56-57
    2.3.5 纳米粒子的细胞相容性  57-59
    2.3.6 细胞吸收试验  59-60
  第四节本章小结  60-62
第三章基于苯硼酸和乳糖基元之间共价键结合构筑高分子复合纳米粒子作为胰岛素鼻腔给药载体的研究  62-90
  第一节引言  62-63
  第二节实验方法  63-72
    3.2.1 试剂与仪器  63-65
    3.2.2 2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯（LAMA）的合成  65
    3.2.3 3-丙烯酰胺基苯硼酸（APBA）的合成  65
    3.2.4 链转移剂 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸（CPADB）的合成  65
    3.2.5 链转移剂三硫代碳酸酯（DMP）的合成  65-66
    3.2.6 均聚物聚(2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯)（pLAMA）的合成  66
    3.2.7 均聚物聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸)（pAPBA）的合成  66-67
    3.2.8 pLAMA 和 pAPBA 的表征  67
    3.2.9 pAPBA/pLAMA 复合纳米粒子的制备  67-68
    3.2.10 pAPBA/pLAMA 复合纳米粒子的表征  68-69
    3.2.11 负载胰岛素的 pAPBA/pLAMA 纳米粒子的制备  69
    3.2.12 载药纳米粒子的包封率和载药量的测定  69
    3.2.13 载药纳米粒子的体外释放实验  69
    3.2.14 pAPBA/pLAMA 复合纳米粒子的细胞毒性试验  69-70
    3.2.15 pAPBA/pLAMA 纳米粒子的细胞吸收实验  70-71
    3.2.16 大鼠鼻腔给药试验  71
    3.2.17 pAPBA/pLAMA 纳米粒子对鼻腔的刺激性试验  71-72
  第三节结果与讨论  72-89
    3.3.1 pLAMA 和 pAPBA 的表征  72-74
    3.3.2 pAPBA/pLAMA 复合纳米粒子的制备与表征  74-80
    3.3.3 包封率与载药量  80-82
    3.3.4 体外释放研究  82-83
    3.3.5 细胞相容性试验  83-85
    3.3.6 细胞吸收试验  85-86
    3.3.7 鼻腔给药试验  86-88
    3.3.8 pAPBA/pLAMA 纳米粒子的鼻腔刺激性  88-89
  第四节本章小结  89-90
第四章基于苯硼酸的水凝胶的合成、表征及其作为多肽、蛋白质类药物载体的研究  90-104
  第一节引言  90
  第二节实验部分  90-95
    4.2.1 试剂与仪器  90-92
    4.2.2 单体 3-丙烯酰胺基苯硼酸（APBA）的合成  92
    4.2.3 单体 2-乳糖酰胺基乙基甲基丙烯酸酯（LAMA）的合成  92
    4.2.4 RAFT 试剂三硫代碳酸酯（DMP）的合成  92
    4.2.5 大分子 RAFT 试剂 pAPBA 的合成  92
    4.2.6 p(APBA-b-LAMA) 水凝胶的制备  92-93
    4.2.7 p(APBA-b-LAMA) 水凝胶的表征  93-94
    4.2.8 胰岛素负载及体外释放  94
    4.2.9 圆二色法分析释放胰岛素的活性  94
    4.2.10 p(APBA-b-LAMA)水凝胶的细胞毒性  94-95
  第三节结果与讨论  95-103
    4.3.1 p(APBA-b-LAMA) 水凝胶的制备与表征  95-99
    4.3.2 体外释放及释放数据模拟分析  99-101
    4.3.3 释放胰岛素的稳定性  101-102
    4.3.4 细胞毒性  102-103
  第四节本章小结  103-104
第五章全文结论  104-106
参考文献  106-118
致谢  118-119
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  119-120

基于苯硼酸的黏附性高分子药物载体研究

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