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醇脱氢酶A在嗜热厌氧乙醇杆菌乙醇代谢中的功能

作　者: 邱日永
导　师: 邵蔚蓝
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物技术
关键词: 醇脱氢酶A 嗜热厌氧乙醇杆菌 穿梭载体 乙醇
分类号: TQ223.122
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


醇脱氢酶A(AdhA)是高温厌氧细菌乙醇代谢途径中的一种关键酶。在对高温厌氧细菌纤维素乙醇发酵研究工作中因为嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaer-obacter ethanolicus)拥有代谢速度快、水解纤维素能力强、戊糖转化率高等优点而获得了研究人员的较大的关注。本文以来源于嗜热厌氧乙醇杆菌JW200中的醇脱氢酶A基因adhA为研究对象。构建重组表达质粒pHsh-adhA和穿梭载体pTE-ori-adhA和pTE-ori-adhE-adhA。在E. coli DH10B内得到表达的AdhA,通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Cibacron Blue3GA Agarose亲和层析两步纯化后得到纯酶,纯化的AdhA在SDS-PAGE胶上为单一电泳条带。通过对AdhA酶学性质相关研究发现：AdhA催化乙醛到乙醇的最适温度为60℃,最适pH为7.79,但当温度高于65℃或pH大于8.0酶的活性急剧下降；AdhA催化乙醇到乙醛的最适温度为70℃,最适pH为5.0,但当温度高于85℃或pH低于4.0和大于6.0时酶的活性急剧下降：AdhA在5.8～7.2的pH范围内比较稳定,相对活性均保持在80%以上,而当pH高于7.5则很不稳定；在45℃和50℃时酶的稳定性都很高,温育2h后仍保留80%以上的相对活性,55℃下的半衰期约为1h；Zn2+能显著提高AdhA的活性,而Cu2+,Fe3+和SDS对酶的活性有较强的抑制作用。在最适条件下,AdhA有着明显的醇脱氢酶活性(即催化乙醛到乙醇的可逆反应),实验结果发现AdhA的催化特性：乙醛到乙醇反应活性(比酶活为10.88±0.20U/mg)比乙醇到乙醛反应的活性(比酶活为8.32±0.14U/mg或8.72±0.18U/mg)要高,这说明AdhA起到促进乙醇产生的作用；乙醇的浓度的升高(20mmol/L到1%)导致乙醇到乙醛的反应活性的增强(8.32±0.14U/mg到8.72±0.18U/mg)；说明随着乙醇的浓度的升高,AdhA消耗乙醇的能力越强。在生理条件下,因为受温度、pH、底物与辅酶浓度等众多因素的限制,AdhA主要表现出乙醇到乙醛反应活性,而只有微弱的乙醛到乙醇反应活性,也就是说主要起消耗乙醇的作用；随着乙醇浓度的升高AdhA催化乙醇到乙醛的活性也增强,当乙醇浓度为2mmol/L时AdhA催化乙醇到乙醛反应的比酶活分别为0.27±0.01U/mg(pH7.2)和0.17±0.0U/mg(pH6.6),而当环境中的乙醇达到一定浓度的时候(乙醇浓度1%),其比酶活分别为1.56±0.05U/mg(pH7.2)和11.42±0.06U/mg(pH6.6).通过超声波转化和抗性筛选的方法得到四种不同的重组菌T. ethanolicus JW200(pTE-ori), T. ethanolicus JW200(pTE-ori-adhE), T. ethanolicus JW200(pTE-ori-adhA)和T. ethanolicus JW200(pTE-ori-adhE-dhA),分别对四种重组菌的乙醇产量进行测定发现,AdhE起催化产生乙醇的作用,AdhA起催化消耗乙醇的作用,并且当两者同时存在于T. ethanolicus JW200中起催化作用时,AdhA消耗乙醇的活性高于AdhE产生乙醇的活性。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-9
第一章 绪论  9-17
  1.1 嗜热厌氧乙醇杆菌的简介  9
  1.2 嗜热厌氧乙醇杆菌中乙醇代谢途径关键酶的研究  9-10
  1.3 醛/醇脱氢酶的研究  10-12
    1.3.1 醛/醇脱氢酶E的简介  10-11
    1.3.2 嗜热厌氧杆菌中醛/醇脱氢酶的研究进展  11-12
  1.4 醇脱氢酶  12-15
    1.4.1 醇脱氢酶的总介  12-13
    1.4.2 嗜热厌氧乙醇杆菌中醇脱氢酶B的研究进展  13-14
    1.4.3 醇脱氢酶A的简介  14
    1.4.4 嗜热厌氧乙醇杆菌中醇脱氢酶A的研究进展  14-15
  1.5 立题背景及本文研究内容  15-17
    1.5.1 立题背景  15-16
    1.5.2 本文研究内容  16-17
第二章 嗜热厌氧乙醇杆菌醇脱氢酶A克隆、表达及定性  17-34
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 菌种与质粒  17
    2.1.2 培养基  17
    2.1.3 主要化学试剂及酶  17-18
    2.1.4 主要仪器设备  18-19
    2.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务  19
  2.2 方法  19-27
    2.2.1 T.ethanolicus JW200基因组的提取及检测  19-20
    2.2.2 分子生物学基本操作  20-22
    2.2.3 醇脱氢酶A的基因克隆及表达  22-24
    2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  24
    2.2.5 蛋白质浓度的测定  24-25
    2.2.6 NADPH和NADH的标准曲线  25-26
    2.2.7 醇脱氢酶A酶活测定方法  26-27
    2.2.8 醇脱氢酶A的酶学性质分析  27
  2.3 结果与分析  27-32
    2.3.1 目的片段adhA克隆  27-28
    2.3.2 表达质粒pHsh-adhA的构建  28
    2.3.3 醇脱氢酶A在E.coli DH10B中的表达及纯化  28-29
    2.3.4 醇脱氢酶A的酶学性质  29-32
  2.4 讨论  32-34
第三章 嗜热厌氧乙醇杆菌乙醇代谢途径中醇脱氢酶A的生理功能研究  34-46
  3.1 材料  34-36
    3.1.1 菌种与质粒  34
    3.1.2 培养基和培养基的配制  34-36
    3.1.3 主要试剂  36
    3.1.4 主要仪器设备  36
  3.2 方法  36-39
    3.2.0 电转化感受态细胞的制备  36
    3.2.1 T.ethanolicus JW200基因组的提取及检测  36-37
    3.2.2 基因操作  37
    3.2.3 穿梭质粒pTE-ori-adhA和pTE-ori-adhE-adhA的构建  37
    3.2.4 蛋白质浓度的测定  37
    3.2.5 NADPH和NADH的标准曲线  37
    3.2.6 醇脱氢酶A可逆反应的酶活测定  37
    3.2.7 嗜热厌氧杆菌胞内NADH和NAD~+的测定  37-38
    3.2.8 嗜热菌的超声波转化  38-39
    3.2.9 乙醇产量的测定  39
  3.3 结果与分析  39-43
    3.3.1 质粒pTE-ori-adhA和pTE-ori-adhE-adhA的构建  39-41
    3.3.2 醇脱氢酶A最适条件下的催化特性  41
    3.3.3 醇脱氢酶A生理条件下的催化特性  41-43
    3.3.4 重组质粒转化嗜热厌氧乙醇杆菌JW200后乙醇产量  43
  3.4 讨论  43-46
第四章 全文总结  46-47
参考文献  47-52
致谢  52

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