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湖南十字花科作物根肿病菌生理小种鉴定及土壤根肿病菌PCR分子检测

作　者: 彭沙莎
导　师: 刘二明
学　校: 湖南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 十字花科作物根肿病生理小种 PCR检测土壤理化特性
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由芸薹属根肿病菌侵染引起的十字花科作物根肿病是重要的土传病害之一1984年首次报道湖南出现根肿病,近年来,该病在湖南地区发生面积呈上升趋势,对十字花科作物构成严重威胁。根肿病的主要防治措施是利用抗病品种,由于根肿病菌存在致病性分化,抗病品种种植数年后会丧失抗性。因此,本论文开展了湖南地区根肿病菌的生理小种(致病型)组成、土壤根肿病菌的PCR快速检测技术及根肿病高发地区的土壤理化特性与病害发生关系的研究,主要研究结果如下。1、采集湘西南怀化、湘北益阳、湘中株洲和长沙4个地区的十字花科作物白菜、榨菜、红菜苔和油菜根肿病株,用Williams根肿病鉴别品种对其进行生理小种鉴定。鉴定结果初步表明：目前湖南白菜根肿病菌为生理小种1号、4号、9号和13号,榨菜根肿病菌为生理小种1号,红菜苔根肿病菌为生理小种4号和9号,油菜根肿病菌为生理小种4号和13号；其生理小种地区分布,湘西南怀化白菜和榨菜分别为生理小种13号和1号,湘北益阳红菜苔为生理小种1号,湘中株洲油菜为生理小种4号和13号,湘中长沙白菜和红菜苔根肿病菌均为生理小种9号。2、选取8个根肿组织基因组DNA和4个带菌土壤基因组DNA作为模板DNA,选用已报道的12对根肿菌特异性引物进行PCR扩增进行筛选比较。经检测引物1/引物2的常规PCR扩增结果与GZ10/GZ11和GZ12/GZ13的巢式PCR扩增结果稳定性好,可重复性强,这3对引物可用于湖南地区根肿病菌的PCR快速检测。引物1/引物2检测根肿病菌的灵敏度为2.6×10-6mg/L,而巢式PCR引物检测根肿菌的灵敏度为2.6×10-7mg/L。用常规PCR引物1/引物2,以湖南不同地区采集的各十字花科作物根肿病株的DNA为模板,进行PCR特异性扩增,均能获得约500bp左右的特异性片段,而作为阴性对照的健康植株和无DNA模板对照中未获得任何扩增产物。3、利用白菜感病品种检测了梯度稀释浓度的接种土壤根肿病发病情况,并采用巢式PCR对上述土壤进行了闽值检测。结果表明：103～109个孢子/g土均能引起白菜根肿病的发生,且病情指数随土壤中休眠孢子浓度的升高而上升。利用巢式PCR可以检测到病情指数高于11.43的土壤中的根肿病菌。4、采集湘西南怀化、湘北益阳和常德、湘中株洲和长沙等根肿病区不同发病程度的土壤,提取土壤基因组DNA,用巢式PCR检测土壤中的根肿病菌。23份土壤中有17份土壤均可以扩增到277bp的特异性片段,其余6份病情指数均低于5的土壤不能扩增出片段。5、检测了23份土样的pH值、全氮含量、有机质含量、阳离子交换量、交换性钙含量和交换性镁含量等6项理化指标,研究了它们与该土样根肿病病害严重度的关系。结果初步表明：土壤pH值在偏酸性的情况下,根肿病的发病更严重；土壤的全氮含量、CEC和交换性镁含量与根肿病的发生呈正相关；土壤的有机质含量和交换性钙含量与根肿病的发生无明显相关性；土壤的酸碱性与交换性钙含量协同影响根肿病的发生。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-13
第一章文献综述  13-23
  1 根肿病菌的生理小种分化  13-16
    1.1 Williams根肿病菌生理小种鉴别系统  14
    1.2 ECD根肿病菌生理小种鉴别系统  14-16
  2 根肿病菌检测技术的研究进展  16-19
    2.1 诱饵植株法  16-17
    2.2 荧光显微镜技术  17
    2.3 血清学技术  17-18
    2.4 PCR技术  18-19
  3 土壤的理化特性与根肿病发生的关系  19-21
    3.1 根肿病菌的生活史  19-20
    3.2 土壤的理化特性  20-21
      3.2.1 土壤酸碱性  20
      3.2.2 氮素  20
      3.2.3 有机质  20-21
      3.2.4 阳离子交换量  21
      3.2.5 交换性钙镁  21
  4 本研究的目的及意义  21-23
第二章湖南十字花科作物根肿病菌生理小种鉴定  23-29
  1 材料与方法  23-27
    1.1 供试品种  23
    1.2 供试病株及来源  23
    1.3 主要实验仪器及耗材  23-24
    1.4 试验方法  24-27
      1.4.1 种子的消毒与催芽  24-25
      1.4.2 接种菌液的制备  25
      1.4.3 接种方法  25
      1.4.4 病情调查  25-26
      1.4.5 生理小种划分标准  26-27
  2 结果与分析  27-28
  3 小结与讨论  28-29
第三章土壤根肿病菌的PCR分子检测  29-47
  1 材料与方法  29-36
    1.1 供试病株及土壤  29-31
    1.2 主要仪器及试剂  31-32
      1.2.1 主要仪器  31
      1.2.2 引物  31
      1.2.3 主要化学试剂及试剂盒  31-32
    1.3 试验方法  32-36
      1.3.1 供试病株模板DNA的提取(CTAB法)  32-33
      1.3.2 供试病株模板DNA的提取(离心柱型试剂盒提取法)  33
      1.3.3 带菌土壤模板DNA的提取方法(根际土壤DNA提取方法)  33-34
      1.3.4 带菌土壤模板DNA的提取方法(MoBio PowerSoil Isolation试剂盒法)  34
      1.3.5 琼脂糖凝胶检测提取的DNA  34
      1.3.6 根肿病菌特异性引物筛选  34
      1.3.7 PCR扩增产物的检测  34
      1.3.8 筛选引物的灵敏度检测  34
      1.3.9 土壤中不同根肿病菌休眠孢子浓度与根肿病病情关系  34-36
    1.4 供试土样根肿病菌的检测  36
      1.4.1 供试土样中根肿病菌的PCR检测  36
      1.4.2 供试土样根肿病病情测定  36
    1.5 数据分析  36
  2 结果与分析  36-45
    2.1 不同方法提取根肿组织基因组DNA的效果比较  36
    2.2 不同方法提取带菌土壤总DNA的效果比较  36-37
    2.3 根肿病菌特异性引物筛选  37-39
    2.4 引物的灵敏度检测  39-41
    2.5 湖南地区供试病株的PCR检测  41
    2.6 土壤中不同根肿病菌休眠孢子浓度与根肿病病情关系  41-43
      2.6.1 不同根肿病菌休眠孢子浓度土壤的病情表现  41-43
      2.6.2 不同根肿病菌休眠孢子浓度的土壤的PCR检测  43
    2.7 湖南地区供试土壤的PCR检测  43-45
  3 小结与讨论  45-47
    3.1 小结  45-46
    3.2 讨论  46-47
第四章土壤理化特性与根肿病发病的关系  47-51
  1 材料与方法  47-48
    1.1 材料  47
      1.1.1 供试土样的采集与保存  47
      1.1.2 主要实验仪器及耗材  47
    1.2 试验方法  47-48
      1.2.1 供试土样的理化指标的测定方法  47-48
  2 结果与分析  48-50
    2.1 土壤的理化特性与病情指数的关系  48-50
      2.1.1 土壤pH值对根肿病病情的影响  49
      2.1.2 全氮含量对根肿病病情的影响  49
      2.1.3 土壤有机质含量对根肿病病情的影响  49
      2.1.4 土壤阳离子交换量对根肿病病情的影响  49
      2.1.5 土壤交换性钙含量与根肿病病情的影响  49-50
      2.1.6 土壤交换性镁含量与根肿病病情的影响  50
  3 小结与讨论  50-51
第五章结论与创新点  51-52
  1 结论  51
    1.1 湖南十字花科作物根肿病菌的小种鉴定  51
    1.2 土壤中根肿病菌的PCR检测  51
    1.3 土壤理化特性与根肿病发生的关系  51
  2 创新点  51-52
参考文献  52-62
缩略词表  62-63
附录1 主要化学试剂的配制  63-64
附录2 植物基因组DNA提取试剂盒步骤  64-65
附录3 MoBio强力土壤基因组DNA提取试剂盒步骤  65-66
附录4 不同引物PCR反应条件  66-68
致谢  68-70
个人简介  70

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