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丁香假单胞效应蛋白AvrRpt2抑制植物免疫分子机制的研究

作　者: 崔福浩
导　师: 简恒
学　校: 中国农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 生长素信号传导效应蛋白致病性先天免疫蛋白降解
分类号: S432.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

自然界中,植物能抵抗绝大多数微生物的侵染,主要是因为植物细胞具有能识别微生物保守分子模式的受体,这些受体能把胞外信号传递到胞内,触发植物的先天免疫反应。病原物在与植物长期互作过程中进化出效应蛋白,这些效应蛋白能够抑制植物的先天免疫反应,从而使病原物可以成功地侵染特定的植物；另一方面,植物进化了能直接或间接识别病原物效应蛋白的抗病蛋白,激发植物的过敏反应而产生对病原物的抗性。本研究以拟南芥和J‘香假单胞杆菌互作系统为模式,研究丁香假单胞杆菌效应蛋白AvrRpt2在植物中发挥毒性功能的分子机制。在携有抗病基因RPS2的拟南芥植物上,AvrRpt2能剪切植物蛋白RIN4, RIN4的剪切能激活RPS2,启动基因对基因的抗性。在拟南芥rps2突变体中,RIN4被AvrRpt2剪切后不能被植物感知,AvrRpt2进而能发挥毒性作用,抑制植物的免疫反应。但是,AvrRpt2发挥毒性功能的分子机制并不清楚。前期研究报道了AvrRpt2可以促进拟南芥生长素合成与生长素信号传导,并且生长素处理能使拟南芥更易感病。以此研究结果为依据,推测AvrRpt2可能作用于生长素信号传导中某个(些)组分。为验证这一推测,本研究在拟南芥原生质体和转基因植株中检测了AvrRpt2对生长素信号途径中关键转录抑制蛋白Aux/IAA及生长素受体TIR1的影响。研究发现AvrRpt2在原生质体中瞬时表达时能促进Aux/IAA的降解,并增强生长素信号传导；另外,在病原细菌侵染过程中AvrRpt2也能显著促进AXR2的降解。AXR2氨基酸位点突变体axr2-1(AXR2P87S)对AvrRpt2介导的降解不敏感。同时发现,AvrRpt2和生长素在促进生长素信号传导过程中具有叠加效应,其促进Aux/IAA降解的功能均依赖于26S蛋白酶体,其中AvrRpt2作用的发挥也依赖于自身的半胱氨酸蛋白酶的活性。实验结果还表明,AvrRpt2介导的AXR2降解与AvrRpt2的毒性功能相关,而与其无毒功能无关。另外,利用丁香假单胞杆菌Ⅲ型分泌系统突变体hrcC和pFRK1::Luciferase系统筛选得到多个拟南芥先天免疫突变体,为深入研究植物先天免疫信号途径提供了新材料。其中,突变体aggie101在接菌hrcC后pFRK1::Luciferase的表达明显上调,但该突变体不能感知细菌鞭毛蛋白,但对丁香假单胞病原细菌表现出更强的抗性。综上所述,丁香假单胞效应蛋白AvrRpt2可以通过促进拟南芥生长素信号途径中关键转录抑制蛋白Aux/IAA的降解来增强植物对生长素的响应,抑制寄主植物的免疫反应,有利于病原细菌的生长和繁殖。除此之外,研究所获得的突变体对揭示植物免疫信号途径中新的关键组分与机制提供了重要材料。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
缩略词中英文对照表  10-11
第一章文献综述  11-24
  1.1 绪论  11-18
    1.1.1 PAMP触发的免疫反应(PTI)  12-15
    1.1.2 效应蛋白触发的免疫反应(ETI)  15-16
    1.1.3 效应蛋白可以抑制PTI信号途径  16-18
  1.2 植物生长素在植物-病原细菌互作中的作用  18-19
  1.3 图位克隆与基因组测序  19-23
    1.3.1 正向遗传学  19
    1.3.2 EMS突变筛选  19-20
    1.3.3 图位克隆  20-23
  1.4 本研究的目的和意义  23-24
第二章 AvrRpt2参与植物生长素信号途径分子机制的研究  24-50
  2.1 引言  24
  2.2 实验材料  24-27
    2.2.1 植物材料  24
    2.2.2 菌株、质粒和引物  24-26
    2.2.3 培养基和溶液  26-27
    2.2.4 常用酶和试剂  27
    2.2.5 主要仪器与设备  27
  2.3 实验方法  27-33
    2.3.1 植物培养  27
    2.3.2 拟南芥总RNA提取  27-28
    2.3.3 RNA反转录  28
    2.3.4 目的基因的扩增  28-29
    2.3.5 目的片段的纯化回收  29
    2.3.6 将目的片段连入pHBT载体  29-30
    2.3.7 质粒DNA提取  30-31
    2.3.8 拟南芥原生质体转化  31
    2.3.9 Western印迹  31-32
    2.3.10 原生质体中报告基因的检测  32
    2.3.11 植物抗病性检测  32-33
    2.3.12 荧光定量PCR检测基因的表达  33
  2.4 结果与分析  33-47
    2.4.1 AvrRpt2能促进Aux/IAA的降解  33-36
    2.4.2 AvrRpt2在病原细菌侵染过程中能促进AXR2的降解  36-37
    2.4.3 AvrRpt2介导的植物生长素响应依赖于其自身半胱氨酸蛋白酶活性  37-40
    2.4.4 AvrRpt2介导的AXR2降解依赖于26S蛋白酶体  40-41
    2.4.5 AvrRpt2不能介导对axr2-1(AXR2P87S)的降解  41-42
    2.4.6 AvrRpt2介导的AXR2的降解与AvrRpt2的毒性功能相关  42-45
    2.4.7 AvrRpt2介导的AXR2的降解与AvrRpt2的无毒功能无关  45-47
  2.5 小结与讨论  47-50
第三章拟南芥PTI信号途径突变体的筛选  50-61
  3.1 引言  50
  3.2 实验材料  50-51
    3.2.1 植物材料  50
    3.2.2 菌株  50-51
    3.2.3 培养基和溶液  51
    3.2.4 主要仪器与设备  51
  3.3 实验方法  51-54
    3.3.1 植物培养  51-52
    3.3.2 荧光素酶活性测定  52
    3.3.3 拟南芥基因组DNA提取  52
    3.3.4 拟南芥总蛋白提取  52-53
    3.3.5 拟南芥MAPK蛋白激酶活性检测  53
    3.3.6 拟南芥总RNA提取  53
    3.3.7 RNA反转录  53
    3.3.8 突变体抗病性检测  53
    3.3.9 突变体活性氧爆发检测  53
    3.3.10 突变体幼苗生长抑制实验  53
    3.3.11 荧光定量PCR检测内源基因表达  53-54
  3.4 结果与分析  54-59
    3.4.1 aggie101中pFRK1：：LUC的表达受hrcC菌株强烈诱导  54
    3.4.2 aggie101中pFRK1：：LUC受flg22的诱导表达较野生型显著下降  54-55
    3.4.3 flg22对aggie101幼苗的生长抑制作用减弱  55-56
    3.4.4 aggie101中flg22处理后诱导的MAPK激酶活性较野生型显著降低  56
    3.4.5 aggie101中活性氧产生显著下降  56-57
    3.4.6 flg22不能诱导aggie101对P.s.t DC3000侵染的抗性  57-58
    3.4.7 aggie101对病原细菌的抗性显著增强  58
    3.4.8 引起aggie101表型的基因位于拟南芥第四条染色体  58-59
    3.4.9 aggie101的生长表型与bak1-4类似  59
  3.5 小结与讨论  59-61
第四章结论与展望  61-62
参考文献  62-71
致谢  71-73
个人简历  73

丁香假单胞效应蛋白AvrRpt2抑制植物免疫分子机制的研究

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