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多重耐药金葡菌的筛选及体内清除机制的研究

作　者: 李秀梅
导　师: 田晶；杨宏军
学　校: 大连工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 金葡菌耐药性奶牛乳腺炎牛γ-干扰素临床治疗
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

奶牛乳腺炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus以下简称金葡菌),临床上主要采用抗生素治疗乳腺炎。由于抗生素的大量不规范使用,导致大量耐药菌的产生。研究金葡菌的耐药谱、耐药基因及机体清除机制,对于指导金葡菌引起的奶牛乳腺炎的治疗和临床规范用药具有十分重要的意义。本实验选取六种新型抗生素,分析121株金葡菌对六种新型抗生素的耐药谱。将金葡菌菌液涂布于血琼脂平板上,将六种抗生素药敏片均匀贴于平板上,经37℃培养12h后,测定各抑菌圈直径。根据2010年美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)的指南M100-S20版判读结果。结果显示,121株金葡菌中,耐甲氧西林金葡菌(meticillin resistant S.aureus,MRSA)为26株；甲氧西林敏感菌(meticillin sensitive S. aureus,MSSA)为93株；中介菌株为2株。同时通过最低抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration,MIC)法,检测金葡菌对六种消毒剂的耐受性。发现121株金葡菌中,对稀戊二醛、聚维酮碘、月苄三甲氯铵、二氯已氰尿酸钠、84消毒液和碘伏耐受的菌株分别有95株、65株、65株、10株、3株和0株。通过PCR法检测金葡菌的耐药基因可知,MSSA、MRSA和中介株中检测出耐甲氧西林基因(mecA)的菌株数分别为：0、9和1；121株金葡菌中检测出11株携带耐消毒剂基因(qacA/B)。通过以上实验得知,MSSA对大部分抗生素仍保持良好的敏感性,而MRSA表现为多重耐药性。金葡菌对月苄三甲氯铵、聚维酮碘和稀戊二醛有较强耐受性；碘伏、二氯已氰尿酸钠和84消毒液对金葡菌的杀菌率均达到90%以上,金葡菌的耐药性和耐药基因之间有一定的关联。本实验无菌采集牛外周血,并从中分离出淋巴细胞,提取牛的总RNA,经RT-PCR得到cDNA,根据Genebank上公布的BoIFN-y基因序列,设计特异性引物,PCR扩增得到BoIFN-y,构建原核表达载体,IPTG诱导表达重组BoIFN-γ。经过SDS-PAGE和western blot验证,重组BoIFN-y成功表达。纯化的重组BoIFN-y,肌肉注射体细胞数(somatic cell count, SCC)在1×106/mL以上且感染金葡菌的奶牛,实验组白细胞总数(white blood cell, WBC)和SCC明显下降。对照组WBC和SCC呈上升趋势。本实验显示,重组BoIFN-y对临床奶牛乳腺炎有一定的疗效,可明显降低牛的WBC和SCC。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 课题背景  11-12
    1.1.1 奶牛乳腺炎  11
    1.1.2 奶牛乳腺炎的病因  11-12
  1.2 金葡菌引起的奶牛乳腺炎研究现状  12-13
    1.2.1 金葡菌综述  12
    1.2.2 金葡菌引起的奶牛乳腺炎的研究现状  12
    1.2.3 耐药金葡菌  12-13
      1.2.3.1 MRSA的生物学特性  12-13
      1.2.3.2 MRSA的耐药机制  13
  1.3 奶牛乳腺炎的治疗  13
  1.4 IFN-γ的研究进展  13-16
    1.4.1 IFN的来源  13-14
    1.4.2 IFN的结构和分类  14-15
    1.4.3 IFN-γ的生物学活性  15-16
      1.4.3.1 IFN-γ调节免疫的作用  15
      1.4.3.2 IFN-γ的抗肿瘤活性  15
      1.4.3.3 IFN-γ抗病毒活性  15-16
    1.4.4 γ-干扰素在奶牛乳腺炎上的应用  16
      1.4.4.1 防治乳腺炎的生物制剂  16
      1.4.4.2 奶牛乳腺炎疫苗的佐剂  16
  1.5 存在的问题和展望  16-17
  1.6 研究的内容和意义  17-19
    1.6.1 研究内容  17
    1.6.2 研究的意义  17-19
第二章多重耐药金葡菌的筛选及耐药基因的检测  19-29
  2.1 实验材料  19-21
    2.1.1 菌种和材料  19
    2.1.2 试剂  19
    2.1.3 主要仪器设备  19-20
    2.1.4 主要试剂的配制  20-21
  2.2 实验方法  21-23
    2.2.1 金葡菌的复苏及重新鉴定  21
    2.2.2 药敏试验  21
    2.2.3 最低抑菌浓度法(MIC)测定金葡菌对消毒剂的耐受性  21
    2.2.4 耐药基因检测  21-23
      2.2.4.1 引物设计及合成  21-22
      2.2.4.2 金葡菌基因组DNA的提取  22
      2.2.4.3 PCR 检测  22-23
      2.2.4.4 电泳检测  23
  2.3 结果与分析  23-27
    2.3.1 金葡菌对抗生素的耐药结果  23-24
    2.3.2 金葡菌对消毒剂敏感性检测  24-26
    2.3.3 基因检测  26-27
  2.4 讨论  27-28
  2.5 小结  28-29
第三章重组BoIFN-γ的基因克隆、载体构建、诱导表达及蛋白纯化  29-41
  3.1 材料和方法  29-36
    3.1.1 实验动物  29
    3.1.2 菌株和载体  29
    3.1.3 工具酶和试剂  29
    3.1.4 引物  29-30
    3.1.5 主要仪器设备  30
    3.1.6 主要试剂的配制  30
    3.1.7 实验方法  30-36
      3.1.7.1 牛外周血淋巴细胞的分离与诱导培养  30-31
      3.1.7.2 牛外周血总RNA的提取  31
      3.1.7.3 反转录获得牛的cDNA  31-32
      3.1.7.4 PCR扩增BoIFN-γ  32
      3.1.7.5 PCR产物的回收  32-33
      3.1.7.6 目的片段与T载体的连接  33
      3.1.7.7 重组质粒的转化  33
      3.1.7.8 重组质粒的提取  33
      3.1.7.9 重组质粒的双酶切鉴定  33-34
      3.1.7.10 重组质粒和载体的双酶切  34
      3.1.7.11 目的片段与表达载体pET-32a(+)的连接  34-35
      3.1.7.12 重组质粒的转化  35
      3.1.7.13 重组质粒的提取  35
      3.1.7.14 重组载体的PCR鉴定和双酶切鉴定  35
      3.1.7.15 重组BoIFN-γ基因的诱导表达  35
      3.1.7.16 SDS-PAGE凝胶电泳  35-36
      3.1.7.17 western blot验证  36
      3.1.7.18 重组BolFN-γ融合蛋白的纯化  36
  3.2 结果  36-40
    3.2.1 牛外周血淋巴细胞总RNA完整性检测  36-37
    3.2.2 cDNA的PCR扩增结果  37
    3.2.3 重组质粒的鉴定  37-38
    3.2.4 双酶切鉴定结果  38-39
    3.2.5 BoIFN-γ的诱导表达和蛋白纯化  39-40
  3.3 讨论  40
  3.4 小结  40-41
第四章重组BoIFN-γ对临床奶牛乳腺炎的治疗效果  41-45
  4.1 材料  41
    4.1.1 实验动物  41
    4.1.2 主要仪器设备  41
  4.2 实验方法  41-42
    4.2.1 肌肉注射实验动物  41
    4.2.2 血常规检测  41-42
    4.2.3 DHI测定牛奶的体细胞数  42
    4.2.4 数据处理  42
  4.3 结果和分析  42-44
    4.3.1 对血常规指标的影响  42-43
      4.3.1.1 对白细胞总数的影响  42
      4.3.1.2 对中性粒细胞百分比(%)的影响  42-43
      4.3.1.3 对淋巴细胞百分比(%)的影响  43
    4.3.2 对体细胞总数的影响  43-44
  4.4 讨论  44
    4.4.1 IFN-γ对临床奶牛乳腺炎治疗效果  44
      4.4.1.1 IFN-γ对奶牛血常规的变化趋势影响  44
      4.4.1.2 体细胞变化趋势  44
  4.5 小结  44-45
结论  45-46
参考文献  46-49
附录A  49-50
致谢  50

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