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酿酒酵母胞外蛋白酶A活性研究

作　者: 赵睿
导　师: 祖国仁
学　校: 大连工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母蛋白酶A 蛋白酶A酶原催化途径
分类号: TS262.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以酿酒酵母2144为研究对象，采用YNB培养基，对酵母在不同生长条件下发酵液胞外蛋白酶A活性进行研究，验证了高渗条件下酵母提前分泌蛋白酶A酶原的现象并对蛋白酶A酶原的两种催化途径进行了比较研究。1.通过对酵母在不同生长条件下发酵液胞外蛋白酶A活性研究发现：发酵液pH5.5，发酵温度29℃，发酵时间36~40h条件下在糖浓度2%~16%水平时蛋白酶A活性相对较高。当糖浓度为20%水平发酵进行16h时出现较高活性，同时发现在高渗培养条件下菌体对数期显著延长，进入稳定期后出现二次生长现象。2.利用高糖浓度YNB培养基培养，以Sephadex G-25和Sephadex G-75为分离手段，以SDS-PAGE以及蛋白酶A专一性荧光底物的检测方法为分析手段，确定蛋白酶A酶原在高糖浓度条件下在培养前期由酵母分泌到发酵液中，这是酵母细胞在高渗条件下的一种应激反应。3.通过调节发酵液pH和加入蛋白酶B抑制剂PMSF两种途径研究酵母胞外蛋白酶A自主催化，发现在正常条件和高渗条件下，pH都是影响发酵液中蛋白酶A活性的主要因素，两种培养条件在pH5.5水平酵母胞外蛋白酶A活性都相对较高。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-23
  1.1 概述  10
  1.2 蛋白酶在酿造过程中的来源  10-11
  1.3 蛋白酶 A 的生化特性  11-14
    1.3.1 蛋白酶的分泌途径  12-13
    1.3.2 蛋白酶 A 在液泡外的活性  13-14
  1.4 蛋白酶 A 的结构  14-17
  1.5 蛋白酶 A 的激活机制  17-19
  1.6 极端条件下微生物蛋白研究进展  19-21
    1.6.1 极端条件下的微生物蛋白质组学  19-20
    1.6.2 全局网络调控  20
    1.6.3 酵母高渗透压条件下的蛋白质研究  20-21
  1.7 本文主要内容  21
  1.8 本文研究的目的、意义及创新点  21-23
    1.8.1 研究的目的和意义  21-22
    1.8.2 研究的创新点  22-23
第二章酿酒酵母在不同生长条件下胞外蛋白酶 A 的研究  23-35
  2.1 实验材料  23
  2.2 实验仪器  23-24
  2.3 实验药品  24
  2.4 实验方法  24-27
    2.4.1 不同培养条件下酵母的生长培养  24-25
      2.4.1.1 不同 pH 条件下酵母的培养  24
      2.4.1.2 不同温度条件下酵母的培养  24
      2.4.1.3 不同糖浓度条件下酵母的培养  24-25
      2.4.1.4 不同糖组分条件下酵母的培养  25
      2.4.1.5 不同糖组分与不同糖浓度条件下酿酒酵母菌株的生长量测定  25
    2.4.2 蛋白酶 A 的测定方法  25-27
      2.4.2.1 荧光底物的配制  25
      2.4.2.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制  25
      2.4.2.3 确定蛋白酶 A 分析的激发波长（λex）和发射波长（λem）  25-26
      2.4.2.4 蛋白酶 A 测定原理和基本方法  26-27
      2.4.2.5 蛋白酶 A 标准曲线的确定  27
  2.5 结果与讨论  27-33
    2.5.1 普通葡萄糖培养基生长条件下酵母胞外蛋白酶 A 的活力测定  27-28
    2.5.2 不同 pH 培养基生长条件下酵母胞外蛋白酶 A 的活力测定  28-29
    2.5.3 不同温度培养条件下酵母胞外蛋白酶 A 的活力测定  29
    2.5.4 不同糖浓度培养条件下酵母胞外蛋白酶 A 的活力测定  29-30
    2.5.5 不同糖组分在糖浓度分别为 2%和 20%培养条件下酵母菌株生长量测定以及酵母胞外蛋白酶 A 活力测定  30-33
  2.6 小结  33-35
第三章高糖浓度下酿酒酵母提前分泌蛋白酶 A 酶原的研究  35-44
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 材料  35-36
      3.1.1.1 实验菌株  35
      3.1.1.2 供试培养基  35
      3.1.1.3 荧光底物[2～6]  35
      3.1.1.4 试剂配制  35-36
      3.1.1.5 实验仪器  36
    3.1.2 方法  36-37
      3.1.2.1 酵母分泌蛋白酶 A 酶原的制备  36
      3.1.2.2 蛋白酶原收集洗脱条件  36-37
      3.1.2.3 SDS-PAGE 分析  37
      3.1.2.4 蛋白酶 A 测定的基本方法  37
      3.1.2.5 显微镜观察酵母细胞形态  37
  3.2 结果与讨论  37-43
    3.2.1 不同糖浓度下酵母培养 16h 发酵液蛋白酶 A 活力测定  37-38
    3.2.2 Sephadex G-25 分离酵母在不同葡萄糖浓度下的分泌蛋白  38-39
    3.2.3 Sephadex G-75 分离酵母在高葡萄糖浓度下的分泌蛋白  39
    3.2.4 SDS-PAGE 分析  39-40
      3.2.4.1 分泌蛋白的 SDS-PAGE 分析  39
      3.2.4.2 分泌蛋白自主催化后的 SDS-PAGE 分析  39-40
    3.2.5 通过荧光手段确定分泌蛋白为蛋白酶 A 酶原  40-41
    3.2.6 显微镜观察酵母菌落形态  41-43
  3.3 小结  43-44
第四章酿酒酵母胞外蛋白酶 A 在两种不同催化途径下的活性研究  44-50
  4.1 材料与方法  44-45
    4.1.1 材料  44-45
      4.1.1.1 实验菌株  44
      4.1.1.2 供试培养基  44
      4.1.1.3 荧光底物  44
      4.1.1.4 试剂配制  44-45
      4.1.1.5 仪器  45
    4.1.2 方法  45
      4.1.2.1 酿酒酵母培养  45
      4.1.2.2 蛋白酶 A 测定的基本方法  45
  4.2 结果与讨论  45-49
    4.2.1 培养基糖浓度为 2%时酵母在不同 pH 条件下培养 40h 时蛋白酶 A 的活力测定  45
    4.2.2 培养基糖浓度为 20%时酵母在不同 pH 条件下培养 16h 时蛋白酶 A 的活力测定  45-47
    4.2.3 在糖浓度 2%的发酵液中加入蛋白酶 B 抑制剂（PMSF）后蛋白酶 A 的活力测定  47
    4.2.4 在糖浓度 20%的发酵液中加入蛋白酶 B 抑制剂（PMSF）后蛋白酶 A的活力测定  47-49
  4.3 小结  49-50
第五章结论  50-51
  5.1 结论  50-51
参考文献  51-55
硕士期间参与的科研项目及成果  55-56
致谢  56

酿酒酵母胞外蛋白酶A活性研究

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