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偏肿革裥菌三个锰过氧化物酶基因在构巢曲霉中的表达

作　者: 胡美美
导　师: 池玉杰
学　校: 东北林业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 偏肿革裥菌 锰过氧化物酶 构巢曲霉 原生质体 表达
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


白腐菌分泌的酶类具有降解木质素的特性,这些酶类主要包括锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、漆酶(Laccase, Lac)和木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase, LiP)等。MnP在生物技术应用中极具吸引力,对于木质素和多环芳烃等多种异生物质,MnP具有独特的胞外降解能力。偏肿革裥菌(.Lenzites gibbosa)具有较强的木质素分解能力,是我国东北林区常见的一种白腐菌,其产MnP和漆酶的活性较高,近年来对其培养特性、MnP和LiP基因克隆与表达等方面已有一系列研究。真核生物表达体系是高效表达蛋白的可行有效方法,但是研究表明偏肿革褶菌锰过氧化物酶在毕赤酵母中表达量较低。丝状真菌的遗传转化体系已经成熟,其中曲霉具有生长迅速、表达量大、胞外分泌率高、生产的外源蛋白具有天然活性等优点。构巢曲霉(Asperglllus nidulans)的转化方法已经成功地建立。研究白腐菌MnP的丝状真菌的转化与表达,为增加酶的产量提供新的途径,对进一步构建优良工程菌株具有重要意义和理论价值。本研究构建了偏肿革裥菌MnP表达重组质粒,摸索并成功制备了构巢曲霉原生质体,采用原生质体转化方法将偏肿革裥菌3个MnP同工酶基因转化到了构巢曲霉中,结果成功获得3个偏肿革裥菌MnP同工酶基因的构巢曲霉工程菌株。主要研究成果如下：本研究首先对构巢曲霉尿嘧啶尿苷营养缺陷体菌株TN02A7进行了制备分生孢子原生质体酶解方法的摸索,结果表明将溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶3种酶以1：1：1的比例混合,能有效地使构巢曲霉的分生孢子形成原生质体。利用RT-PCR方法克隆得到偏肿革裥菌Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3完整MnP同工酶CDS基因。首先构建了载体质粒pMDTM18-T/Lg-mnp1、pMDTM18-T/Lg-mnp2和pMDTM18-T/Lg-mnp3。将pMDTM18-T/Lg-mnp1、pMDTM18-T/Lg-mnp2、pMDTM18-T/Lg-mnp3和整合型表达载体质粒pLB01分别进行双酶切,利用T4连接酶进行连接,成功构建了重组质粒pLB01/Lg-mnp1, pLB01/Lg-mnp2和pLB01/Lg-mnp3。通过CaCl2/PEG原生质体转化的方法,以营养缺陷体菌株TN02A7为宿主菌,将重组质粒整合到构巢曲霉中进行MnP的异源表达,结果筛选到稳定遗传的转化子,成功获得转化子菌株TN02A7-Lg-mnp1、TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3。将转化子菌株、菌株TN02A7和偏肿革褶菌CB1在相同的木质素环境下接种于MMPGRT培养液中进行培养。检测MnP活性,结果表明在诱导表达过程中检测前24h内上清培养液中完全没检测到MnP活性,在24h时后检测到Mnp活性,结果TN02A7-Lg-mnpl, TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3诱导96h后酶活最高分别为26.7U·L-1、17U·L-1和12U.L-1,在120h后活性基本没有变化。而TN02A7始终无MnP酶活性,表明基因Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3已经成功地被转化到构巢曲霉TN02A7-中,并在木质素环境下已得到表达。转化子菌株的MnP表达量要低于原菌株的表达活性。在添加血红素的孢液中测得的MnP酶活性大小和不添加血红素的酶活性大致相同。重组菌株TN02A7-Lg-mnp1、 TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3的生长量随着培养时间变化不断增长。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-16
  1.1 引言  9-10
  1.2 锰过氧化物酶研究进展  10-13
    1.2.1 锰过氧化物酶的酶学性质  10-12
    1.2.2 锰过氧化物酶的应用  12
    1.2.3 锰过氧化物酶基因的表达  12-13
  1.3 丝状真菌表达系统研究进展  13-15
    1.3.1 丝状真菌宿主与选择性标记  13-14
    1.3.2 丝状真菌转化方法  14
    1.3.3 丝状真菌表达载体  14-15
  1.4 研究目的和意义  15
  1.5 研究的主要内容  15
  1.6 课题来源  15-16
2 偏肿革裥菌三个锰过氧化物酶基因重组质粒的构建  16-35
  2.1 材料  16-18
    2.1.1 试验菌种  16
    2.1.2 主要试剂  16
    2.1.3 质粒  16-17
    2.1.4 主要培养基  17-18
    2.1.5 主要仪器设备  18
  2.2 方法  18-25
    2.2.1 偏肿革裥菌的培养和菌丝收集  18
    2.2.2 偏肿革裥菌锰过氧化物酶Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3的完整CDS全长序列扩增  18-22
    2.2.3 偏肿革裥菌锰过氧化物酶Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3的重组质粒的构建  22-25
  2.3 结果与分析  25-34
    2.3.1 偏肿革裥菌锰过氧化物酶Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3的完整CDS全长序列扩增  25-30
    2.3.2 偏肿革裥菌锰过氧化物酶Lg-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3的重组质粒的构建  30-34
  2.4 本章小结  34-35
3 构巢曲霉原生质体制备与偏肿革裥菌MnP基因的表达  35-52
  3.1 材料  35-37
    3.1.1 菌种  35
    3.1.2 质粒  35
    3.1.3 主要培养基  35-36
    3.1.4 转化使用试剂  36
    3.1.5 主要仪器设备  36-37
  3.2 方法  37-40
    3.2.1 构巢曲霉原生质体制备  37-38
    3.2.2 CaCl_2/PEG介导的构巢曲霉转化  38
    3.2.3 转化子的鉴定  38-39
    3.2.4 重组菌株的诱导表达和酶活测定  39-40
  3.3 结果与分析  40-50
    3.3.1 构巢曲霉原生质体制备  40-42
    3.3.2 CaCl_2/PEG介导的构巢曲霉转化  42-43
    3.3.3 转化子的筛选鉴定  43-47
    3.3.4 重组菌株的诱导表达  47-50
  3.4 本章小结  50-52
结论  52-54
参考文献  54-60
附录1 质粒pMD~(TM) 18-T/Lg-mnp1、pMD~(TM) 18-T/Lg-mnp2和pMD~(TM) 18-T/Lg-mnp3验证结果  60-69
附录2 转化子TN02A7-Lg-mnp1、TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3的PCR扩增结果  69-76
攻读学位期间发表的学术论文  76-77
致谢  77-78

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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