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苏云金芽胞杆菌丝氨酸蛋白激酶的功能研究

作　者: 李峰
导　师: 李明顺
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 PrkA 功能研究过表达蛋白质互作
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)为革兰氏阳性细菌,在土壤中广泛存在。与其它芽胞杆菌不同的是其在生长过程中会伴随芽胞的形成而产生具有特异毒性的杀虫晶体蛋白,目前已发现对有害生物具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌就有上千种。根据不同生长时期苏云金芽胞杆菌YBT-1520匕较蛋白质组研究,在苏云金芽胞杆菌稳定期后期有一种丝氨酸蛋白激酶(PrkA)大量表达,并且表现出明显的磷酸化图谱,而苏云金芽胞杆菌的芽胞和伴胞晶体也是在稳定期中后期才形成的,因此推断PrkA蛋白与苏云金芽胞杆菌芽胞和伴胞晶体合成有密切关系。PrkA蛋白最早在枯草芽胞杆菌中分离得到,只检测到丝氨酸蛋白磷酸化活性,其生物学功能尚未明了,因此通过对PrkA蛋白进行功能验证,期望揭示PrkA在苏云金芽胞杆菌的代谢活动中所参与的调控作用,同时揭示PrkA对苏云金芽胞杆菌芽胞的形成及杀虫晶体蛋白表达之间的关系,以求对伴胞晶体的形成机制有更加深入的了解。1.本课题是对PrkA蛋白进行功能验证,首先通过PrkA过表达实验对过表达菌株和野生株进行生理特性比较,发现PrkA过表达菌株较野生株其菌液不易出现沉降现象,且其芽胞和伴胞晶体的形成时间提前。2. PrkA的motif搜索结果发现其含有Sigma-54interaction domain,因而需要对PrkA与Sigma54进行互作验证,验证通过GST pull-down技术和细菌双杂交技术完成,经验证PrkA与Sigma54之间无相互作用。3.为了寻找与PrkA互作的蛋白,首先将prkA目的基因插入表达载体pGEX构建原核表达载体质粒,再转化大肠杆菌表达菌株BL21表达纯化GST-PrkA融合蛋白；然后通过GST pull-down技术和双向电泳实验寻找可能与PrkA存在相互作用的蛋白,对特异蛋白条带进行质谱鉴定；最后,对质谱鉴定得到的九种蛋白进行功能分析,猜测菌液沉降实验与PrkA对GGDEF family protein的调节有关,而芽胞和伴胞晶体的提前形成与PrkA对GGDEF family protein和transcriptional regulator TetR的调节有关。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
1 前言  11-24
  1.1 苏云金芽胞杆菌  11-13
    1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介  11-12
    1.1.2 苏云金芽胞杆菌的分类  12-13
  1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白  13-15
    1.2.1 杀虫晶体蛋白的分类和结构  13-14
    1.2.2 杀虫晶体蛋白的作用机制  14-15
  1.3 丝氨酸蛋白激酶相关研究  15-17
    1.3.1 蛋白激酶简介  15-16
    1.3.2 枯草芽胞杆菌中prkA基因的鉴定  16
    1.3.3 人体病原菌李斯特菌的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶PrkAc  16-17
  1.4 蛋白功能研究的相关技术  17-22
    1.4.1 研究蛋白互作的几种方法  17-19
      1.4.1.1 细菌双杂交技术  17-18
      1.4.1.2 GST pull-down技术  18-19
      1.4.1.3 噬茵体展示技术  19
      1.4.1.4 等离子共振技术  19
      1.4.1.5 免疫共沉淀技术  19
    1.4.2 双向电泳技术  19-21
    1.4.3 蛋白质的质谱鉴定  21-22
  1.5 本课题的立题背景及研究的目的意义  22-24
2. 材料与方法  24-39
  2.1 实验材料  24-26
    2.1.1 菌株和质粒  24-25
    2.1.2 培养基的配制及主要成分  25
    2.1.3 抗生素及使用浓度  25-26
  2.2 试剂和仪器  26-30
    2.2.1 常用试剂  26
    2.2.2 常用缓冲液和溶液  26-29
      2.2.2.1 质粒抽提、感受态细胞制备试剂配方  26-27
      2.2.2.2 大肠杆菌蛋白表达、纯化及浓度测定试剂配方  27
      2.2.2.3 SDS-PAGE试剂配方  27-28
      2.2.2.4 双向电泳试剂配方  28-29
    2.2.3 常用仪器  29-30
  2.3 实验方法  30-39
    2.3.1 质粒与总DNA的抽提  30-31
      2.3.1.1 大肠杆菌质粒的提取  30
      2.3.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提  30-31
      2.3.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提  31
    2.3.2 分子克隆相关实验操作  31-33
      2.3.2.1 PCR扩增  31-32
      2.3.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  32
      2.3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化  32-33
    2.3.3 过表达实验相关操作  33-34
      2.3.3.1 过表达质粒的构建  33
      2.3.3.2 过表达质粒电转化YBT-881  33
      2.3.3.3 苏云金芽胞杆菌生长曲线的绘制  33-34
    2.3.4 蛋白互作相关实验  34-39
      2.3.4.1 PrkA与Sigma54的互作验证  34
      2.3.4.2 GST-PrkA蛋白的纯化  34-35
      2.3.4.3 寻找与GST-PrkA互作的蛋白  35
      2.3.4.4 SDS-PAGE操作  35-36
      2.3.4.5 双向电泳实验操作  36-39
3 结果与分析  39-55
  3.1 prkA基因的生物信息学分析  39-40
    3.1.1 prkA基因的操纵子预测  39
    3.1.2 prkA上下游基因分析  39-40
  3.2 过表达Bt菌株和野生株的生理特性比较  40-45
    3.2.1 过表达Bt菌株的构建  40-42
    3.2.2 YBT-881PHTPrkA和YBT-881PHT1K生长特性比较  42
    3.2.3 YBT-881PHTPrkA和YBT-881PHT1K生理特性比较  42-45
      3.2.3.1 YBT-881PHTPrkA和YBT-881PHT1K的SDS-PAGE分析  42-43
      3.2.3.2 YBT-881PHTPrkA和YBT-881PHT1K菌液沉降比较  43
      3.2.3.3 YBT-881PHTPrkA和YBT-881PHT1K菌体细胞的显微观察  43-45
  3.3 寻找与PrkA互作的蛋白  45-55
    3.3.1 PrkA与Sigma54的互作验证  45-49
      3.3.1.1 pull-down技术验证PrkA与Sigma54的互作  45-47
      3.3.1.2 细菌双杂交验证PrkA与Sigma54的互作  47-49
    3.3.2 GST pull-down技术寻找与PrkA互作的蛋白  49-55
      3.3.2.1 GST-PrkA的表达与纯化  49-50
      3.3.2.2 GST pull-down实验寻找与PrkA互作的蛋白  50-51
      3.3.2.3 质谱鉴定结果  51-52
      3.3.2.4 待验证蛋白的功能简介  52-55
4 讨论  55-57
参考文献  57-65
致谢  65-66
附录  66-67
  附录1：prkA基因序列  66-67
  附录2：sigma54基因序列  67

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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