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基于DNA适体的生物传感信号增强方法的设计与应用

作　者: 程盛
导　师: 葛学武
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 生物传感器适配体(适体) 纳米金链替换反应信号增强
分类号: Q523
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

传感系统中最重要的两个部分是识别单元和信号转换单元。在过去的几十年中,各种各样的分子识别单元被开发了出来,例如酶,凝集素,分子印迹技术,抗体以及适体(适配体)。适配体是单链的核酸分子,对特定的目标物具有高度的亲和力。其作为一种多功能的分子感受器已经被广泛的研究和应用。随着对传感系统灵敏度要求的增加,多种通过信号增强或扩增的手段来提高化学/生物传感的灵敏度的方法已经被设计出来。本研究致力于在DNA适配体为基的生物传感中信号增强方法的设计与应用。本论文的主要内容包括以下五个方面：1.因其独特的光学性能,尤其是其高摩尔吸光系数(是普通的有机发光团的3-5个数量级),纳米金在本工作中作为信号增强单元,同时又是信号转换单元,来构建铅离子(Pb2+)检测的生物传感系统。本论文的第一项工作是用两条富含G碱基的序列(TBA (5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’)和PW17(5’-GGG TAG GGC GGG TTG GG-3’))作为Pb2+的识别原件来做传感系统。其原理是无修饰的纳米金能够识别非折叠结构的DNA和折叠结构的DNA,比如G四联体。圆二色光谱表征了这些TBA-Pb2+和PW17-Pb2+所形成的G四联体。紫外吸收差谱证明了在Pb2+响应上序列的特异性。透射电子显微镜和紫外光谱表征了柠檬酸钠还原法合成的纳米金。本研究优化了实验条件,包括盐浓度,单链DNA浓度和加盐之后聚集时间。本工作构建的对Pb2+检测的传感系统能达到30nM的检测下限。结果表明,PW17的体系在铅检测中展现出了更加优异的性能。在相同的DNA浓度下,PW17体系对Pb2+浓度的变化有更大的响应和较小的误差线。2.为了探明TBA体系和PW17体系在铅检测性能上的不同,我们研究了G四联体与无修饰纳米金之间的相互作用。研究发现G四联体溶液具有保护纳米金的作用,表明仍有DNA吸附在了纳米金表面。这一现象不同于以往的结论,即G四联体不能吸附在纳米金表面并保护纳米金。我们通过跟踪纳米金的表面等离子体共振吸收(A650/A520)对时间的变化曲线研究了纳米金对G四联体溶液中DNA的吸附行为。这项研究包含了三个体系：TBA,PW17和PSO。结果表面,在Pb2+稳定的G四联体溶液中通过5小时的作用大约有93%的DNA被吸附在了纳米金上。这一结果可能是两种原因导致的：(1)G四联体能吸附在纳米金表面；(2)G四联体解缠了进而吸附在了纳米金表面。为了探明原因,我们采用了电感耦合等离子体发射光谱分析了溶液中Pb2+浓度。结果发现G四联体与纳米金作用后吸附在纳米金表面,但Pb2+存留在了水中。这表明G四联体可能被解缠了从而释放出了Pb2+。PW17-Pb2+在纳米金上的吸附速度比TBA-Pb2+更慢,说明PW17-Pb2+形成的G四联体更稳定。这也就解释了两者在铅检测中的差异。在对PSO-K+的体系中,我们观察到了相似的吸附现象,说明G四联体在纳米金存在下的解缠可能是一个普遍的现象。这种相互作用表明长时间的相互作用使得纳米金无法区分非折叠的和折叠的DNA。3.将巯基修饰的DNA化学键合在纳米金的表面可以避免2中所叙述的问题。在这一部分中,我们用巯基修饰的裂开型适配体设计了一种新型的DNA-纳米金传感系统。在这里ATP被选用为模型分子。ATP的适配体被切为两段,每段在5’端或3’端修饰了巯基。这样,每种纳米金上修饰了同一序列但适配体片段的方向不同,即有的是5’端键接在纳米金表面,有的是3’端键接在纳米金表面。所以这样得到的每种纳米金都是双修饰的。由于在目标分子的存在下,裂开的适配体片段能和目标分子重新组合成完整的适配体二级结构,因此其与纳米金的复合物能产生目标分子诱导的组装,进而由于纳米金颜色的距离依赖性使其颜色发生由红到紫的变化。在新设计的双修饰DNA-纳米金体系中,我们发现此体系对ATP产生的表面等离子体共振吸收变化是传统的单修饰体系的两倍。本工作通过跟踪纳米金的表面等离子体共振吸收研究了不同修饰方式,镁离子浓度和适配体链段在纳米金表面的密度对该体系在目标分子存在下的组装动力学。在最优实验条件下,对ATP的检测可达到24μtM的检测下限,这个结果优于传统组装方法对ATP的检测。4.然而,双修饰的纳米金-DNA体系对目标分子的响应只是产生两倍于常规的修饰方法的信号增强。因此,我们设计了基于链替换反应的催化循环来放大信号。该体系包括了一个由两步链替换反应组成的熵驱动的催化循环。一共有五条链参与了这个循环,分别表示为"Substrate-1","Fuel-1","Catalyst-1","C1" and "C2"。"Catalyst-1"是ATP的适配体,其在这个催化循环中起催化剂的作用促成"Substrate-Fuel-1"双链的形成。催化循环过程中的各组分通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以证明。由于ATP的引入导致“Catalyst-1"这条链与其相互作用形成了G四联体的结构,从而使其失去了催化活性并抑制‘"Substrate-Fuel-1"双链的形成。很显然这种目标分子抑制的催化循环可用来进行ATP的检测。当核酸链"Substrate-1"和‘"Fuel-1"标记了FAM荧光基团和DABCYL淬灭集团后,催化反应的进程因"Substrate-Fuel-1"双链形成导致的荧光共振能量转移而反映出来。该荧光基团标记的催化体系对ATP的检测显示出"switch on"的响应。在优化了实验条件后,包括催化剂浓度,镁离子浓度,孵化温度等,该体系可以对ATP达到50nM的检测下限和上至1400nM的线性范围。这种目标分子抑制的催化循环提供了一利无酶的传感手段并有前景应用于其他基于适配体的信号放大的传感系统。5.上述目标分子抑制的催化循环反应体系中存在这么几个问题：检测过程是多步操作并且十分费时(总过程8小时)。因此我们在这部分工作中设计了目标分子触发的催化循环体系。相比于上述的目标分子抑制的催化体系,该触发型体系除了包含基于链替换反应的催化循环,还包含一步用于释放催化剂链的目标分子诱导的链替换反应。对ATP的检测是通过在"Substrate-2"和“C4”链上分别标记FAM和DABCYL来实现的。ATP的加入引发了核酸链"Catalyst-2"从双链"Catalyst-2-ATP aptamer"上的释放,进而催化了下面的催化循环。这样原本以双链状态结合的"Substrate-2"和“C4”就因"Substrate-2-Fuel-2"的形成而分开,并伴随着荧光的出现。用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征反应过程的各组分证明了该催化特性。催化过程通过跟踪催化体系的荧光变化得以表征。优化了实验条件后,该目标分子触发的催化体系提供了更为灵敏的检测性能(对ATP的检测下限为20nM)。最重要的是,该反应速度很快,整个检测操作过程小于一个小时。

全文目录

ABSTRACT  6-10
ACKNOWLEDGEMENTS  10-14
LIST OF FIGURES AND SCHEMES  14-21
LIST OF TABLES  21-22
ABBREVIATIONS  22-24
Chapter 1 General Introduction  24-48
  1.1 Recognition Elements in Biosensing  26-29
    1.1.1 Non-DNA-based Recognition Elements  26-27
    1.1.2 DNA-based Recognition Elements  27-29
  1.2 Reporting Strategies in Aptamer-based Biosensing  29-40
    1.2.1 Colorimetric Strategies  30-35
    1.2.2 Fluorescence Strategies  35-39
    1.2.3 Electrochemical and Other Strategies  39-40
  1.3 Signal Enhancement Strategies in Aptamer-based Biosensing  40-46
    1.3.1 Catalytic Nucleic Acid (DNAzyme)-based Amplification  40-41
    1.3.2 Nanoparticles-based Amplification  41-42
    1.3.3 Enzyme-Assisted Target or DNA Strands Recycling  42-44
    1.3.4 Rolling-Cycle Amplification (RCA)  44-45
    1.3.5 Enzyme-Free Amplification Strategies  45-46
  1.4 Objectives of This Thesis  46-48
Chapter 2 Detection of Pb~(2+) using Unmodified AuNPs as SignalEnhancement and Transduction Element  48-62
  2.1 Introduction  50-51
  2.2 Experimental section  51-52
    2.2.1 Materials and Apparatus  51
    2.2.2 Synthesis of AuNPs  51-52
    2.2.3 CD Measurements  52
    2.2.4 Detection of Pb~(2+)  52
  2.3 Results and Discussion  52-61
    2.3.1 The principle of the Sensing System  52-53
    2.3.2 Characterization of the G-quadruplex Formation using CD and Absorption Difference Spectra  53-55
    2.3.3 Characterization of AuNPs  55-56
    2.3.4 Optimization of the Sensing System  56-58
    2.3.5 Performance of the Two Sensing System, TBA and PW17  58-61
  2.4 Conclusion  61-62
Chapter 3 The Unfolding of G-quadruplexes in the Presence of AuNPs  62-80
  3.1 Introduction  64-65
  3.2 Experimental Section  65-67
    3.2.1 Materials and Apparatus  65-66
    3.2.2 CD Measurements  66
    3.2.3 Adsorption Kinetics of Random Coiled ssDNAs and G-quadruplexes onto AuNPs  66-67
    3.2.4 Preparation of Samples for ICP-AES  67
    3.2.5 Non-denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis  67
  3.3 Results and Discussion  67-77
    3.3.1 The Study on the Interaction between G-quadruplexes and AuNPs  68-77
    3.3.2 Effect of the Potential Unfolding of G-quadruplex to Sensing System  77
  3.4 Conclusion  77-80
Chapter 4 Double-Functionalized Gold Nanoparticles with SplitAptamer for the Detection of Adenosine Triphosphate  80-92
  4.1 Introduction  82-83
  4.2 Experimental Section  83-85
    4.2.1 Materials and Apparatus  83-84
    4.2.2 Preparation of AuNPs-DNA Conjugates  84-85
    4.2.3 ATP Response  85
  4.3 Results and Discussion  85-91
    4.3.1 Design and Working Principle of the Double-Functionalized AuNP-DNA Sensing System  85-87
    4.3.2 Effect of Mg~(2+) Concentrations and Aptamer Fragments Densities  87-89
    4.3.3 Sensitivity and Selectivity  89-91
  4.4 Conclusion  91-92
Chapter 5 A Strand Displacement Reaction Cycle Catalyzed by ATP Aptamer and Its application in the Detection of ATP  92-106
  5.1 Introduction  94-95
  5.2 Experimental Section  95-98
    5.2.1 Materials and Apparatus  95-96
    5.2.2 Non-denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis  96-97
    5.2.3 Demonstration of the Catalytic SDR Cycle with Labeled Oligonucleotides  97
    5.2.4 ATP Detection  97-98
  5.3 Results and Discussion  98-104
    5.3.1 Sequence design of the catalytic SDR cycle  98
    5.3.2 Demonstration of the catalytic SDR cycle  98-101
    5.3.3 Optimization of the Biosensing System  101-102
    5.3.4 Sensitivity and Selectivity  102-104
  5.5 Conclusion  104-106
Chapter 6 A Target Triggered Strand Displacement Reaction Cycle:theDesign and Application in ATP Sensing  106-120
  6.1 Introduction  108-109
  6.2 Experimentl Section  109-112
    6.2.1 Materials and Apparatus  109-110
    6.2.2 Non-denaturing PAGE  110-111
    6.2.3 Demonstration of the catalytic SDR cycle with labeled oligonucleotides  111
    6.2.4 ATP Detection  111-112
  6.3 Results and Discussion  112-119
    6.3.1 Sequence Design of the Target Triggered Cycle  112
    6.3.2 Demonstration of the Catalytic SDR Cycle  112-116
    6.3.3 Effect of Mg~(2+) Concentration on the Sensing System  116-117
    6.3.4 Sensitivity and Selectivity  117-119
  6.4 Conclusion  119-120
Chapter 7 Conclusion and Future work  120-124
Chapter 8 References  124-146
APPENDIX Ⅰ. ARTICLES  146-148
APPENDIX Ⅱ. Simplified Version of This Thesis in Chinese  148-164

基于DNA适体的生物传感信号增强方法的设计与应用

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