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金属离子驱动的DNA分子折叠及其协助下的链替换反应

作　者: 丁伟
导　师: 梁好均
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: DNA与离子相互作用、DNA-金属碱基对分子折叠发夹等温滴定微量热技术 metallo-toehold DNA分支迁移 DNA链替换反应 DNA分子机器
分类号: Q523
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

富含胸腺嘧啶(T)碱基与胞嘧啶碱基(C)的长单链DNA分子是一种柔性很强的生物大分子。它能够在汞离子与银离子的驱动下通过形成T-Hg-T以及C-Ag-C的金属-碱基对从而发生分子内折叠形成特殊结构。在本论文中,我们采用等温滴定微量热技术(ITC)监测了汞离子与富T碱基长单链DNA的相互作用并测定了二者结合的各项热力学参数。结合圆二色谱的结果我们发现这种相互作用是放热过程且伴随着熵减小——体系由无序化转向有序化的过程——长链富T碱基DNA分子在汞离子驱动下能够发生自我折叠形成发夹结构。同时我们发现,外界环境促发DNA无规单链强行折叠成发夹的过程中,DNA趋向于尽量使得发夹双臂的链接环存有4或5个碱基的链段。进一步的,我们利用得出的DNA单链发夹折叠原则设计了一种富含T、C碱基的DNA序列。我们利用ITC、CD、荧光等技术手段探究了这种DNA序列在汞离子与银离子的驱动下发生构象转变的机理,这种探究拓展了我们对于金属-DNA复合物的理解。DNA在这两种离子的驱动下都能发生分子折叠成为发夹。这种分子折叠存在着两种路径——发生在发夹尾端的高熵变的路径与发生在靠近发夹环内部的低熵变路径。这两种路径的最终产物都只有一个。与汞离子反应后的DNA-Hg复合物能与银离子发生相互作用形成更为稳定而完美的发夹结构,而这种结合就发生在发夹不完美的部分。UV滴定数据佐证了ITC的结合位点数是正确的,CD与荧光的表征手段验证了中间过程与最终形态的发夹构象。更改离子的加入顺序,DNA会有不同的发夹折叠方式,这对于离子驱动的DNA分子机器与含有离子参与的DNA纳米技术都有着非凡的意义。DNA的折叠是个非常复杂的过程,同样的离子改变加样顺序结果都会不同。在银离子条件下,DNA采取了一种新发现的不同于传统的C-Ag-C的金属-碱基配对：T-Ag-C。这种配对方式形成了更多的金属-碱基对,使得DNA采取了一种不完美的发夹折叠方式。它同时也封闭住了体系中大多数的T碱基,在大大提升了DNA与银离子结合能力的同时,也大大的降低甚至是基本上杜绝了DNA与汞离子反应的活性——汞离子的后续加入不再能使DNA链段发生有效的折叠。这种发夹结构是不完美的但是却是稳定的。最后一章中,我们提出了一种新型的可用于调控DNA链替换反应速率的新方法。我们引入了一个全新的概念：metallo-toehold,并利用其构建了汞离子驱动DNA链替换反应的体系。我们发现利用汞离子浓度的不同我们可以很方便且很灵敏的对单一目标DNA体系调控其链替换反应的速率。通过形成稳定的T-Hg-T金属碱基对弥补了碱基错配所带来的障碍,合适的汞离子浓度会极大地促进DNA链替换反应的进行。但是物极必反,过高浓度的汞离子浓度会因为封闭T碱基而阻滞DNA分支迁移的进行。这种抑制作用可以随着汞离子被其他强结合物质(如DTT)捕缚而得到解放。这种在汞离子不同浓度下,metallo-toehold DNA体系的特性让我们调控其链替换反应速度与效率提供了可能。这种DNA链替换反应驱动体现出了极佳的离子选择性。我们还可以通过对链段的设计实现其他特征金属离子(如银离子)对DNA链替换反应的驱动。该方法不仅在离子检测上有着一席之地,还具有着构建金属-DNA纳米结构的潜质。由于与当今两大热门领域：离子-DNA相互作用以及DNA链替换反应联系紧密,因此在DNA分子机器领域将大有可为。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章绪论  12-24
  1.1 DNA化学组成及其基本结构  12-13
  1.2 DNA的二级结构  13-14
  1.3 DNA与金属离子的相互作用  14-19
    1.3.1 汞离子与胸腺嘧啶(T)的相互作用  15-16
    1.3.2 银离子与胞嘧啶(C)的相互作用  16-17
    1.3.3 汞、银离子与其他碱基的特殊作用  17-18
    1.3.4 汞、银离子作用下的DNA链段转变  18-19
  1.4 DNA纳米技术  19-20
  1.5 DNA链替换反应  20-24
第二章等温滴定量热法原理及应用  24-32
  2.1 引言  24-25
  2.2 ITC原理及特点  25-28
  2.3 ITC的应用介绍  28-29
  2.4 本论文拟用ITC解决的问题  29-32
第三章汞离子驱动下富T碱基DNA分子的发夹折叠  32-46
  3.1 引言  32-33
  3.2 实验部分  33-36
    3.2.1 实验试剂  33-34
    3.2.2 DNA预处理  34-35
    3.2.3 测试方法  35-36
  3.3 结果与讨论  36-43
    3.3.1 汞离子与富T碱基的长单链DNA相互作用  36-39
    3.3.2 汞离子驱动下富T碱基的单链DNA发夹的环结构  39-40
    3.3.3 成键T碱基的间距对于汞离子驱动DNA分子折叠的影响  40-43
  3.4 本章小结  43-46
第四章汞、银离子双驱动下的DNA分子折叠  46-62
  4.1 引言  46-47
  4.2 实验部分  47-50
    4.2.1 实验试剂  47
    4.2.2 DNA预处理  47-48
    4.2.3 测试方法  48-50
  4.3 结果与讨论  50-60
    4.3.1 汞、银离子驱动下C3 DNA的发夹折叠机理的热力学过程  50-56
    4.3.2 C3 DNA发夹折叠的圆二色谱分析  56
    4.3.3 C3 DNA发夹折叠的紫外平衡滴定  56-58
    4.3.4 C3 DNA发夹折叠的荧光表征  58-60
  4.4 本章小结  60-62
第五章金属离子加入次序影响下的DNA分子折叠  62-76
  5.1 引言  62
  5.2 实验部分  62-65
    5.2.1 实验试剂  62-63
    5.2.2 DNA预处理  63-64
    5.2.3 测试方法  64-65
  5.3 结果与讨论  65-74
    5.3.1 不同加入次序下TCO DNA的发夹折叠机理及热力学过程对比  65-69
    5.3.2 TCO DNA双离子驱动分子折叠的圆二色谱分析对比  69-71
    5.3.3 TCO DNA双离子驱动分子折叠的荧光表征  71-73
    5.3.4 TCO DNA双离子驱动分子折叠的模型与机理  73-74
  5.4 本章小结  74-76
第六章汞离子驱动下的DNA链替换反应  76-94
  6.1 引言  76-79
  6.2 实验部分  79-81
    6.2.1 实验试剂  79
    6.2.2 DNA预处理  79-80
    6.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  80
    6.2.4 荧光光谱测量及动力学分析  80-81
  6.3 结果与讨论  81-91
    6.3.1 汞离子驱动下的DNA链替换反应及汞离子浓度对反应速率的影响  81-85
    6.3.2 汞离子驱动下的DNA链替换反应凝胶电泳结果  85-86
    6.3.3 汞离子驱动下的DNA链替换反应中其他因素的影响  86-90
    6.3.4 其他离子驱动DNA分子链替换反应  90-91
  6.4 本章小结  91-94
参考文献  94-106
致谢  106-108
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  108

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