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非接触共培养条件下兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞诱导分化的实验研究

作　者: 武海军
导　师: 银和平
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 兔 骨髓间充质干细胞 密度梯度离心法 贴壁培养法 体外培养 兔髓核细胞 聚集蛋白聚糖 Ⅱ型胶原 髓核细胞 非接触式共培养
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）分离培养、鉴定和扩增的方法，同时观察BMSCs的生长特性。方法应用密度梯度离心和贴壁筛选法相结合分离纯化BMSCs并在体外扩增，利用倒置显微镜对各代BMSCs的生长情况及形态进行对比，对BMSCs的数目进行计数，绘制BMSCs的生长曲线图。对BMSCs行HE染色后观察其形态学特征，免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达，进行表型鉴定。结果在体外成功的实现了兔BMSCs的培养与增殖。观察发现前3代的BMSCs增殖速度较快，生长旺盛，随着BMSCs的不断传代增殖活力逐渐降低。分离培养的BMSCs阳性表达CD29，CD44，阴性表达CD34。结论体外应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合，可获得高纯度的BMSCs，培养的BMSCs呈纤维状、克隆样生长，第1-3代细胞活性较强，可作为组织工程的种子细胞用于进一步的实验研究。第二部分不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状目的研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性，旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。方法从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中，分离并培养髓核细胞同时进行培养传代，对原代及第3，4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化；甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达；反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平，观察各代髓核细胞生物学特性的变化。结果兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代，原代髓核细胞一般需7d左右贴壁，形状呈类圆形或多角形，前3代髓核细胞都呈圆形或多角形，活力较强，HE染色后细胞核被染成均一蓝黑色，胞浆呈现淡粉色；髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后，胞浆内呈现天蓝色，通过Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色后，胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。结论前三代的髓核细胞代谢旺盛，表型一致，聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常，传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。第三部分非接触共培养条件下兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞诱导分化的实验研究目的研究兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能，为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供大量的细胞来源。方法提取兔BMSCs，进行培养传代至第3代，提取培养兔NPCs，将第3代BMSCs与NPCs按培养要求分为三组，BMSCs单独培养组，NPCs单独培养组，BMSCs与NPCs共培养组，应用Transwell6孔培养板将BMSCs与NPCs进行非接触式共培养。倒置显微镜观察各组细胞的变化，在培养7天后利用免疫细胞化学、RT-PCR及Western-blot技术分别对BMSCs单独培养组、共培养组中BMSCs和NPCs单独培养组中NPCs的Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达进行测定，最后对各组细胞测定的结果进行对比分析。结果成功分离提取兔骨髓间充质干细胞和髓核细胞；免疫细胞化学检测、RT-PCR检测和Western-blot检测结果显示Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖在共培养组中BMSCs的表达与NPCs单独培养组中NPCs的表达相近，较BMSCs单独培养组中BMSCs的表达显著增加。结论兔骨髓间充质干细胞具有向髓核细胞诱导分化的潜能，在BMSCs与NPCs共培养的条件下BMSCs可转化成为NPCs，BMSCs可能为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供足够的细胞来源。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
第一部分 密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察  10-19
  材料与方法  10-11
  结果  11-12
  讨论  12-13
  结论  13-14
  附图表  14-17
  参考文献  17-19
第二部分 不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状  19-32
  材料与方法  19-22
  结果  22-23
  讨论  23-24
  结论  24-25
  附图表  25-30
  参考文献  30-32
第三部分 非接触共培养条件下兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞诱导分化的实验研究  32-47
  材料与方法  32-35
  结果  35-36
  讨论  36-38
  结论  38
  附图表  38-44
  参考文献  44-47
文献综述  47-60
  参考文献  56-60
缩略语表  60-61
攻读学位期间发表文章情况  61-62
个人简历  62-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学 > 人体细胞学
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