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LDR-PCR基因芯片检测混合感染猪病毒研究

作　者: 郭瑶
导　师: 姜永厚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: LDR-PCR 通用芯片杂交多重检测猪病毒
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 33次
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内容摘要

随着全球经济一体化进程的加快,动物的国际贸易日益频繁,贸易规模越来越大,经典的血清学和PCR检测方法已经无法适应进口动物检疫快速、准确、高通量的要求。在很多检测领域都急需一种能同时对多种病原微生物进行检测和鉴定的方法。本研究建立了一种基于LDR-PCR基因芯片技术可同时对六种与呼吸、繁殖疾病相关的猪病毒进行鉴定的检测方法。LDR-PCR方法用于特异和灵敏地扩增病毒基因片段,基因芯片方法有助于实现方法的多重性。连接酶检测反应(LDR)使用耐热的DNA连接酶,当探针与目的DNA互补配对后,连接酶能通过催化磷酸二酯键将相邻的两条探针连接,当探针的接头处存在碱基错配,连接反应便不能进行。这种方法显著减少了探针非特异性连接,被广泛用于检测病原体基因突变、插入和缺失等。基因芯片技术最早用于监控基因表达和DNA序列特异性的点突变,目前较多地应用于环境和临床中的病原微生物检测鉴定。基因芯片为分子诊断技术带来巨大的革命,不仅提高了检测能力,同时也增加了检测的通量。虽然这种技术具有高通量、高集成及微型化的突出优点,但仍有一些不足,如灵敏度和特异性不高。本文在整合LDR、PCR和基因芯片技术的基础上建立了一种同时检测六种猪病毒的方法。首先,从NCBI中查找并下载六种猪病毒的全序列,通过软件比对确定每种病毒序列的保守区,根据其保守序列设计一组LDR探针,每组探针由五段序列组成,从左到右依次是:上游通用序列,上游病毒特异序列,下游病毒特异序列,Zip-code序列和下游通用序列。提取基因组DNA/RNA,以提取出的DNA或反转录出的cDNA为模板进行多重LDR,并以含病毒诊断区的质粒作为标准模板对多重连接反应体系进行了优化,研究了最佳的反应条件。利用通用引物扩增标记连接产物,最后将扩增标记产物与通用芯片杂交检测鉴定靶标序列。本研究建立的基于LDR-PCR基因芯片检测方法可以同时区分六种猪病毒,LDR探针和Zip-code序列的特异性良好,只在芯片目的位点产生信号,其它位点无信号。此方法的检测灵敏度达到10个拷贝,存在两种靶基因时,其中一种病毒模板浓度为105个拷贝,对另一种病毒检测的灵敏度能达到102个拷贝。我们选择比较了引物标记和Cy5-dCTP标记两种方法,结果表明Cy5-dCTP标记方法的检测灵敏度显著高于引物标记方法。应用此方法对47个临床样本进行检测,阳性检出率达到78.7%,要高于荧光定量PCR的70.2%,特异性和灵敏度分别为95.7-100%和100%。检测混合感染病毒样本时这种方法更快速,准确。建立的此技术平台也可应用于其它混合感染病原体的检测和鉴定。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-21
  1 猪病毒的危害  12-15
    1.1 猪瘟病毒  12-13
    1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒  13
    1.3 猪圆环病毒  13-14
    1.4 猪细小病毒  14
    1.5 伪狂犬病毒  14
    1.6 乙型脑炎病毒  14-15
  2 猪病毒的诊断方法  15-21
    2.1 利用生物学特性检测  15
    2.2 利用免疫学特性检测  15-17
    2.3 利用基因组特性检测  17-21
第二章实验方案设计  21-23
  1 实验目的和意义  21
  2 实验的主要内容  21-22
  3 实验流程图  22-23
第三章探针和引物的设计  23-28
  1 方法  23-25
  2 探针引物设计结果  25-27
  3 讨论  27-28
第四章多重LDR 条件的优化  28-40
  1 材料  28-30
    1.1 毒株  28
    1.2 试剂及其配制  28-30
  2 方法  30-36
    2.1 核酸提取及反转录  30-32
    2.2 质粒的构建  32-35
    2.3 多重 LDR  35
    2.4 PCR 反应体系  35-36
  3 结果  36-39
    3.1 退火温度的优化  36-37
    3.2 酶量的优化  37
    3.3 探针浓度的优化  37-38
    3.4 最佳模板浓度的确定  38
    3.5 循环数的优化  38-39
  4 讨论  39-40
第五章 LDR-PCR 芯片杂交方法的特异性和灵敏度  40-50
  1 材料  40-41
    1.1 毒株  40
    1.2 试剂及其配制  40-41
  2 方法  41-42
    2.1 LDR 反应体系  41
    2.2 不对称荧光标记PCR  41-42
    2.3 基因芯片的点制  42
    2.4 预杂交、杂交及数据分析  42
  3 结果  42-48
    3.1 两种标记方法杂交结果的比较  42-43
    3.2 单重LDR-PCR 基因芯片方法的特异性  43-44
    3.3 单重LDR-PCR 基因芯片方法的灵敏度  44
    3.4 多重LDR-PCR 基因芯片方法的特异性  44-45
    3.5 多重LDR-PCR 基因芯片方法的灵敏度  45-48
  4 讨论  48-50
第六章临床样本的检测  50-53
  1 材料  50
  2 方法  50-51
    2.1 核酸提取  50
    2.2 LDR-PCR 反应体系  50-51
    2.3 杂交方法  51
  3 结果  51-52
  4 讨论  52-53
总结与展望  53-54
参考文献  54-59
攻读硕士期间发表（投稿）的论文  59-60
致谢  60

LDR-PCR基因芯片检测混合感染猪病毒研究

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