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基于悬浮芯片的病原细菌多重快速检测技术研究

作　者: 赵金银
导　师: 王景林
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 悬浮芯片 病原细菌 多重检测
分类号: Q93-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


与食品、水有关的食源性、水源性病原微生物引起的疾病是威胁人类健康的重要因素,也是造成人类死亡、财产损失的重要原因。目前,对病原微生物的检测主要依靠传统的分离培养和免疫学分析等方法,耗时长、操作繁琐,每次只能确定或排除一种病原体,无法满足公共安全卫生监控、临床诊断、流行病学调查等实际需要。所以,为有效监控食品、生活用水的卫生安全,建立多重、快速、有效的检测技术十分必要。悬浮芯片,也称为液态芯片,是上世纪90年代中期由Luminex公司将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新的生物芯片技术。该技术创新性的将荧光编码的微球作为反应载体,通过调节两种荧光强度最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球。微球悬浮于液相环境中,为生物大分子的反应提供了极佳的反应环境,利于保持核酸、蛋白的天然构象,具有高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、操作简便等特点。本文以常见的病原菌为研究对象,建立基于悬浮芯片技术的多重、快速检测技术平台。选择各病原菌的特异性基因,GenBank获得基因序列,Clustal W比对序列,选择各病原菌的同源区,应用Primer Premier 5.0设计引物及探针,将筛选出的引物及探针进行Blast比对,确定其特异性。将设计的探针进行NH2-C12标记后,与羧基化的色标微球耦联制备悬浮芯片。建立单重及多重PCR反应,采用悬浮芯片技术检测PCR产物,并验证其特异性和灵敏度。最后,通过对实验室模拟样本的检测,评估悬浮芯片技术适用性。通过生物信息学分析和试验验证,筛选出针对五种病原菌的十四对特异性的引物及相应的探针,实现了对每个病原菌的多指标的检测。同时设计了一对通用性的引物和探针作为内参,对PCR反应体系和杂交体系进行监控。对PCR反应条件进行优化,确定了最佳的引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶单位浓度、退火温度等条件。通过采用悬浮芯片和紫外凝胶成像分析两种方法,最终确定的十五对引物浓度在0.02-0.08μM之间。并确定采用不对称PCR扩增方法,可获得较高的MFI值,较佳的Biotin标记引物与非标记引物的比例为5:2。试验证实较佳的Mg2+浓度为1.5 mM。试验发现增加Taq酶的浓度可显著增强多重反应体系中MFI值,当浓度达到1 U/20μl反应体系时,MFI值变化不明显,因此确定在多重检测中,20μl反应体系Taq酶的浓度为1.5 U。通过对十五对引物的生物信息学分析及悬浮芯片验证,最后确定在多重反应体系中能兼容十五对引物的退火温度为53℃。对芯片杂交条件进行优化,确定了最佳的杂交时间、杂交温度。试验证实杂交时间越长,MFI值越高,但考虑到背景信号的影响,同时杂交20 min时就已经具较高的MFI值,因此确定杂交时间为20 min。不同的探针表现出不同的最佳杂交温度,在多重杂交体系中,为兼容十五条探针在同一条件下杂交,确定杂交温度为52℃。基于各病原菌特异性基因建立了十五重检测体系,即可在同一反应体系中同时对志贺氏菌（痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌）、金葡菌、肉毒梭菌（A型、B型、E型）、霍乱弧菌（O1、O139）、嗜肺军团杆菌等进行多重检测;又能分别对痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、金葡菌、肉毒梭菌A型、肉毒梭菌B型、肉毒梭菌E型、霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、嗜肺军团杆菌等各病原菌进行多指标的鉴定。通过对痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O1灵敏度试验。痢疾志贺氏菌单重检测灵敏度两探针均可达到fg水平（1 fg全基因组相当于1-2个细菌）,多重检测IpaH可达到103 fg,Ial为104 fg;霍乱弧菌O1单重检测灵敏度rfbE为100 fg,ct为102 fg,多重检测灵敏度rfbE为102 fg,ct为104 fg;金葡菌单重检测灵敏度nuc、scpA均为101 fg,多重检测灵敏度nuc为102 fg,scpA为104 fg。模拟环境样本污染痢疾志贺氏菌、金葡菌,单重检测灵敏度分别是IpaH为2×103 CFU/100ml、Ial为2×102 CFU/100ml、nuc为2×104 CFU/100ml、scpA为2×106 CFU/100ml;十五重检测灵敏度分别为IpaH为2×104 CFU/100ml、Ial为2×106 CFU/100ml、nuc为2×106 CFU/100ml、scpA为2×107 CFU/100ml。通过对40余株菌株的特异性验证,证明其特异性达100%。还建立了基于16S rDNA和hsp60建立了十三重检测体系,可检测志贺氏菌（含大肠杆菌、沙门氏菌）、金葡菌、霍乱弧菌、嗜肺军团杆菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌,每种菌均有两个指标16S rDNA和hsp60及内参。单重检测灵敏度为101 fg-103 fg,七重检测灵敏度102fg-105 fg,十三重检测灵敏度102fg-105 fg。检测环境模拟痢疾志贺氏菌样本时,16S rDNA的单重检测灵敏度为2×102 CFU/ml,七重检测灵敏度与单重相同,十三重在2×107 CFU/ml时呈明显的阳性信号;hsp60的单重检测灵敏度为2×105 CFU/ml,七、十三重检测灵敏度比单重均降低100倍,为2×107 CFU/ml。PCR具较强的扩增能力和较高的灵敏度,也意味着PCR技术易产生交叉污染。本实验采用UNG酶消化方法来降低PCR交叉污染。试验结果显示UNG可消化1011个拷贝数的IpaH、107个拷贝数的rfbE、1011个拷贝数的rfbX、1011个拷贝数的bont/A、1011个拷贝数的nuc。因此,UNG方法是一种有效的降低PCR交叉污染的方法。本研究建立了基于悬浮芯片技术的多重、快速检测技术平台,该技术快速、灵敏、特异,在公共安全卫生监控、临床诊断、流行病学调查等方面具广泛的应用前景。

全文目录


缩略词表  7-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-14
前言  14-18
第1部分 基于特异性基因的悬浮芯片多重检测病原细菌  18-46
  1.1 材料  18-23
    1.1.1 实验所用菌株及来源  18-20
    1.1.2 培养基  20-21
    1.1.3 主要仪器设备  21
    1.1.4 主要试剂  21-23
  1.2 方法  23-28
    1.2.1 引物的设计与合成  23
    1.2.2 探针及Biotin 标记引物的设计与合成  23
    1.2.3 细菌核酸的提取  23
    1.2.4 悬浮芯片制备  23-24
    1.2.5 悬浮芯片的质控  24
    1.2.6 杂交并检测  24-25
    1.2.7 PCR 扩增条件的确定  25-26
    1.2.8 杂交条件的确定  26
    1.2.9 十五重检测条件的建立  26
    1.2.10 悬浮芯片多重能力验证  26-27
    1.2.11 悬浮芯片定量试验  27
    1.2.12 UNG 预防PCR 产物污染试验  27
    1.2.13 悬浮芯片重复性验证试验  27
    1.2.14 悬浮芯片特异性验证试验  27
    1.2.15 悬浮芯片灵敏度验证试验  27-28
    1.2.16 模拟样本检测  28
  1.3 结果  28-46
    1.3.1 特异性引物及探针  28-30
    1.3.2 多重PCR 反应条件的确定  30-32
    1.3.3 悬浮芯片杂交条件的确定  32-33
    1.3.4 悬浮芯片多重检测结果  33-35
    1.3.5 悬浮芯片多重能力验证  35
    1.3.6 悬浮芯片的半定量结果  35-37
    1.3.7 UNG 预防PCR 产物试验结果  37-39
    1.3.8 悬浮芯片重复性试验验证结果  39
    1.3.9 悬浮芯片特异性验证结果  39-40
    1.3.10 悬浮芯片灵敏度验证结果  40-42
    1.3.11 模拟环境样本结果  42-46
第2部分 基于16S rDNA 和hsp60 的悬浮芯片多重检测病原细菌  46-54
  2.1 材料  46
  2.2 方法  46-47
    2.2.1 引物与探针设计  46
    2.2.2 多重检测条件的建立  46
    2.2.3 特异性验证试验  46-47
    2.2.4 灵敏度验证试验  47
    2.2.5 模拟水样检测试验  47
  2.3 结果  47-54
    2.3.1 种（或属）水平上特异性引物与探针  47-48
    2.3.2 多重检测结果  48-49
    2.3.3 悬浮芯片特异性验证结果  49-50
    2.3.4 悬浮芯片灵敏度试验结果  50-52
    2.3.5 模拟水样检测结果  52-54
第3部分 讨论  54-58
结论  58-60
试验不足之处  60-61
参考文献  61-66
综述  66-73
个人简历  73-74
致谢  74

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物研究与微生物实验
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