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干酪乳杆菌LC2W细胞组分对巨噬细胞活性及细胞因子分泌的影响

作　者: 李瑞君
导　师: 郭本恒
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学
关键词: 干酪乳杆菌LC2W RAW264.7 细菌裂解物胞外多糖细胞因子免疫活性抗炎作用
分类号: R371
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

免疫调节能力作为筛选益生菌的标准和益生菌的重要功能,近些年受到了广泛的关注。益生菌免疫方面的研究日趋系统化,内容涵盖免疫学的各个部分,研究人员致力于益生菌治疗肠道菌群失调、肿瘤、感染等方面的研究,且取得了一定的成果。益生菌制品也作为保健行业的一个新成员有着广阔的发展空间。乳杆菌是肠道土著菌群的重要成员之一,能在肠道中定植,能改善或调节肠道微生物菌群的平衡、增强机体免疫力及抑制肿瘤的形成等。近年来国内外学者认为乳酸杆菌免疫调节作用与其细胞壁组分有关。本文以干酪乳杆菌LC2W为主,通过体外细胞实验,对其细胞裂解物(cell lysate)、细胞壁(cell wall)、细胞质(cytoplasm)以及胞外多糖(EPS)的免疫活性进行了研究。以MRS基础培养基对干酪乳杆菌进行增菌培养,收集对数期菌体,洗涤菌体并采用高压均质破碎菌体细胞,获得细胞裂解物(cell lysate)。将LC2W细胞裂解物经SDS加酶处理,去蛋白、DNA及RNA,获得纯化的细胞壁(cell wall)。离心收集上清,获得细胞质(cytoplasm)。巨噬细胞作为先天性免疫的重要成员,对巨噬细胞的激活与刺激作用是诱导宿主免疫应答的第一步,只有激活的巨噬细胞才能发挥其免疫功能。实验选择观察其受刺激后RAW264.7巨噬细胞形态、MTT代谢水平变化,研究其对巨噬细胞激活途径的影响,结果表明,受刺激后的RAW264.7巨噬细胞形态发生明显变化,在10μg/ml-80μg/ml浓度范围内,对巨噬细胞RAW264.7无明显的损伤作用,并不抑制巨噬细胞RAW264. 7增殖,不影响细胞正常的代谢能力与活性。其次,经10-80μg/mL的干酪乳杆菌细胞裂解物(cell lysate)、干酪乳杆菌LC2W细胞壁(cell wall)和细胞质(cytoplasm)刺激后,巨噬细胞RAW264.7产生的TNF-α、IFN-γ、IL-12显著增加,并呈一定的浓度依赖性。相同浓度下,干酪乳杆菌LC2W、WPC-200、BD-Ⅱ和Shirota四株菌之间对细胞因子的影响差异不明显;细胞壁(cell wall)诱导细胞因子分泌的能力强于细胞质(cytoplasm)。最后,检测了LC2W胞外多糖(EPS)对脂多糖诱导巨噬细胞分泌功能的影响,发现不论是EPS和E.coli脂多糖(LPS)同时加入或是先后间隔24h加入生长良好的RAW264.7细胞中,均能抑制由脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7细胞释放炎症因子TNF-α,IFN-γ和IL-12,同时还能够提高IL-10的分泌。表明LC2W胞外多糖(EPS)具有潜在的抗炎作用。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章绪论  8-19
  1.1 益生菌概述  8
  1.2 免疫系统的组成  8-13
    1.2.1 非特异性免疫  9-10
    1.2.2 特异性免疫  10-11
    1.2.3 细胞因子与免疫  11-13
  1.3 乳酸菌免疫调节作用及机理的研究进展  13-15
    1.3.1 乳酸菌对非特异性免疫功能的影响  13-14
    1.3.2 乳酸菌对特异性免疫功能的影响  14-15
  1.4 常见益生菌免疫调节作用的研究进展  15-17
    1.4.1 干酪乳杆菌免疫调节作用的研究进展  15-16
    1.4.2 鼠李糖乳杆菌免疫调节作用的研究进展  16
    1.4.3 双歧杆菌免疫调节作用的研究进展  16-17
  1.5 关于干酪乳杆菌LC2W 的研究进展  17-19
    1.5.1 LC2W 的胞外多糖及其降血压作用的研究  17-18
    1.5.2 LC2W 细胞壁肽聚糖和磷壁酸及其免疫调节作用的研究  18
    1.5.3 LC2W 细胞壁蛋白质及其粘附作用的研究  18-19
  1.6 课题研究的目的和意义  19
第二章实验材料和方法  19-29
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 菌种和细胞  19-20
    2.1.2 试剂与药品  20-21
    2.1.3 主要试剂的配制方法  21-22
  2.2 研究方法  22-28
    2.2.1 干酪乳杆菌培养及菌体的制备  22-23
    2.2.2 乳杆菌LC2W 胞外多糖（EPS）的提取、分离和纯化  23-24
    2.2.3 干酪乳杆菌细胞裂解物（cell lysate）的制备  24
    2.2.4 干酪乳杆菌LC2W 细胞壁（cell wall）和细胞质（cytoplasm）的制备  24
    2.2.5 RAW264.7 细胞培养  24-26
    2.2.6 巨噬细胞培养及上清液的收集  26-27
    2.2.7 巨噬细胞代谢水平的测定（MTT 毒理实验）  27
    2.2.8 ELISA 测定上清液中TNF-α的含量  27
    2.2.9 ELISA 测定上清液中IFN-γ的含量  27-28
    2.2.10 ELISA 测定上清液中IL-12 的含量  28
    2.2.11 ELISA 测定上清液中IL-10 的含量  28
  2.3 数据分析  28-29
第三章实验结果与分析  29-40
  3.1 乳杆菌菌体破碎效果分析（以LC2W 为例）  29
    3.1.1 超声破碎后的细胞形态变化  29
    3.1.2 平板计数结果  29
  3.2 巨噬细胞外部形态  29-30
  3.3 干酪乳杆菌细胞裂解物（cell lysate）对RAW264.7 增殖活性及细胞因子分泌的影响  30-34
    3.3.1 干酪乳杆菌细胞裂解物（cell lysate）对RAW264.7 增殖活性的影响  30-31
    3.3.2 干酪乳杆菌细胞裂解物（cell lysate）对RAW264.7 细胞因子的影响  31-34
  3.4 干酪乳杆菌LC2W 细胞壁（cell wall）和细胞质（cytoplasm）对RAW264.7 增殖活性及细胞因子分泌的影响  34-37
    3.4.1 干酪乳杆菌LC2W 细胞壁（cell wall）和细胞质（cytoplasm）对RAW264.7 增殖活性的影响  34
    3.4.2 干酪乳杆菌LC2W 细胞壁（cell wall）和细胞质（cytoplasm）对RAW264.7 细胞因子的影响  34-37
  3.5 干酪乳杆菌LC2W 胞外多糖（EPS）对RAW264.7 细胞因子表达的影响  37-40
    3.5.1 LC2W 胞外多糖（EPS）与LPS 共同作用对RAW264.7 细胞释放细胞因子的影响  37-38
    3.5.2 LC2W 胞外多糖对 LPS 刺激的RAW246.7 细胞释放细胞因子的影响  38-39
    3.5.3 LC2W 胞外多糖（EPS）对细胞活力的影响  39-40
第四章讨论  40-49
  4.1 细胞因子和免疫  40-42
  4.2 RAW264.7 细胞及其增殖活性  42-44
  4.3 干酪乳杆菌LC2W 细胞裂解物，细胞壁，细胞质的免疫调节作用  44-47
    4.3.1 感染性疾病和免疫调节剂  44-45
    4.3.2 干酪乳杆菌的免疫调节作用  45-47
  4.4 干酪乳杆菌LC2W 胞外多糖免疫调节作用  47-49
第五章结论与展望  49-51
  5.1 全文主要结论  49-50
  5.2 问题与展望  50-51
参考文献  51-55
致谢  55-56
攻读硕士学位期间发表的论文清单  56

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