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神经性毒剂染毒体内生物标志物的分析方法及其代谢行为研究

作　者: 暴铱
导　师: 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 神经性毒剂 生物标志物 白蛋白 丁酰胆碱酯酶 加合物 液相色谱-串级质谱 同位素稀释 定量分析方法
分类号: R99
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


神经性毒剂(nerve agents, NAs)是一种危害极大的高效速杀型化学战剂,主要通过抑制生物体内的乙酰胆碱酯酶活性发挥其毒理作用。神经性毒剂进入生物体后迅速分布于各组织中,其主要存在形式有毒剂原型、水解产物和大分子加合物。这些化合物在体内的存在能够确证神经性毒剂的中毒、判断毒剂的中毒程度以及评估解毒剂的治疗效果,被称作神经性毒剂的体内生物标志物。神经性毒剂与生物大分子的加合物作为其生物标志物的主要优点在于其良好的溯源性及较高的特异性,配合现代分析仪器的应用能够对低剂量的神经性毒剂中毒实现高灵敏检测。神经性毒剂在生物体内主要与两类生物大分子发生加合反应:胆碱酯酶和白蛋白。神经性毒剂与白蛋白加合物具有高灵敏度,不易发生老化和不受重活化药物治疗影响等突出优点,已逐渐成为近期神经性毒剂生物标志物的研究重点。建立神经性毒剂与生物大分子加合物的分析方法是神经性毒剂中毒的溯源性检测的重要研究基础,对于阐释神经性毒剂在体内的代谢规律及评价药物治疗效果具有重大意义。神经性毒剂与白蛋白加合物的近期研究工作主要集中于通过以不同蛋白酶酶解NAs-白蛋白加合物得到各类检测靶分子,各种新型蛋白质纯化手段也不断得到应用;然而对于该加合物的定量分析方法研究至今仍是该领域的空白,现有技术手段无法对生物样品中的NAs-白蛋白加合物进行准确的定量分析。同时由于定量分析方法的薄弱,对于NAs-白蛋白加合物在体内与染毒剂量的量效关系及随染毒时间变化的时效关系尚未有文献报道,NAs-白蛋白加合物在生物体内的代谢规律亟待研究。本研究课题中首先合成了四种代表性神经性毒剂与白蛋白加合物的检测靶分子膦酰化酪氨酸的参考品,首次合成了其中三种膦酰化酪氨酸的氘代内标物。其次针对神经性毒剂-人血清体外染毒体系,我们巧妙地应用亲和色谱柱的工作原理,对染毒人血清中的膦酰化白蛋白进行提取和富集,并结合固相萃取技术建立了针对神经性毒剂-白蛋白加合物的样品处理方法,在大幅提高方法灵敏度的同时有效地降低了生物样品中复杂成分引入的基质干扰。本研究首次应用氘代内标物建立了针对NAs-白蛋白加合物检测靶分子膦酰化酪氨酸的同位素稀释定量分析方法,并将该方法应用于不同剂量神经性毒剂动物体内染毒实验样品中,得到了染毒剂量与加合物浓度之间的量效关系。本研究论文分为六章:第一章前言,简要介绍了神经性毒剂及其毒理作用,列举了毒剂在生物体内能够产生的生物标志物,比较了各种生物标志物的特点。详细介绍了神经性毒剂体内生物标志物的分析方法,对多种分析方法的优劣性进行了比较,指出了神经性毒剂与大分子加合物分析方法的研究现状和存在的问题,并在此基础上提出了论文的研究目的和研究内容。第二章神经性毒剂与白蛋白加合物参考品及其同位素内标物的合成,参考现有合成方法,对其进行改良和优化,合成了四种代表性神经性毒剂(沙林、梭曼、塔崩和VX)与白蛋白加合物检测靶分子膦酰化酪氨酸的参考品;同时应用相应的氘代醇首次合成了其中三种毒剂(沙林、塔崩和VX)膦酰化酪氨酸的氘代内标物。合成的七种化合物纯度均达到95%以上,符合定量分析方法中对参考品和内标物的要求,为膦酰化酪氨酸同位素稀释定量分析方法提供了良好的技术基础。第三章神经性毒剂与白蛋白加合物体外分析方法的建立,应用合成的膦酰化酪氨酸参考品及其氘代内标物,优化了其在LC-Q-TOF MS/MS中的分析方法,同时巧妙地应用蛋白质组学中去除高丰度蛋白的亲和色谱柱HiTrapTM Blue HP的工作原理,对人血清中高丰度的白蛋白进行提取和富集,并结合固相萃取技术建立了针对神经性毒剂-白蛋白加合物的样品处理方法,在大幅提高方法灵敏度的同时有效地降低了生物样品中复杂成分引入的基质干扰。应用该样品处理方法,以LC-Q-TOF MS/MS对不同剂量染毒的神经性毒剂-人血清体外染毒体系中神经性毒剂与白蛋白加合物进行了定性和半定量分析,该方法能够检测到NAs-白蛋白加合物的最低染毒剂量为:沙林:20 ng/mL人血清,梭曼:5 ng/mL人血清,塔崩:2 ng/mL人血清,与国外文献报道灵敏度相当。发现了梭曼-白蛋白加合物的新检测靶分子梭曼-二肽加合物,弥补了梭曼-酪氨酸加合物的不足,为梭曼-白蛋白加合物的分析检测提供了新的研究方向。第四章神经性毒剂与白蛋白加合物同位素稀释定量分析方法的建立,应用合成的膦酰化酪氨酸参考品及其氘代内标物,优化了其在LC-Triple quadrupole MS/MS中的分析参数。在经HiTrapTM Blue亲和色谱柱和SPE处理的大鼠血清基质中,应用合成的参考品及其氘代内标物建立了大鼠血清基质中膦酰化酪氨酸的同位素稀释定量分析方法。该方法的精密度、回收率和线性范围均符合定量分析的要求,其灵敏度达到:沙林、梭曼与酪氨酸加合物:10 pg/mL,VX与酪氨酸加合物:50 pg/mL。第五章神经性毒剂动物染毒实验样品中白蛋白加合物的定量检测,应用沙林和梭曼两种代表性G类神经性毒剂,以低、中、高三种不同剂量对雄性大鼠进行染毒,同时应用VX以0.7倍的半数致死剂量对大鼠进行高浓度染毒,应用建立的膦酰化酪氨酸同位素稀释定量分析方法,对动物体内染毒实验样品中的膦酰化酪氨酸进行准确的定量检测,同时测定不同毒剂不同剂量染毒样品中的BuChE活性抑制率,得出了神经性毒剂中毒剂量与白蛋白加合物浓度之间的量效关系。第六章神经性毒剂与丁酰胆碱酯酶加合物体外分析方法的建立,制备了丁酰胆碱酯酶的亲和凝胶procainamide-sepharose 4B gel,为染毒血清中神经性毒剂-丁酰胆碱酯酶加合物的分离纯化奠定了基础。应用梭曼对人血清进行体外染毒,以procainamide-sepharose 4B gel纯化,以胃蛋白酶酶解,得到膦酸化的九肽加合物,以LC-Q-TOF MS/MS进行检测,能够测得该加合物的最低染毒剂量为20μg/mL人血清。针对procainamide-sepharose 4B gel和HiTrapTM Blue亲和柱的提取纯化原理,我们设计了在一份染毒血清样品中同时提取白蛋白和BuChE加合物的样品处理流程,提高了血清样品的利用效率。

全文目录


英文缩略词表  7-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
第一章 前言  15-24
  1. 神经性毒剂生物标志物检测方法研究的意义  17-18
  2. 神经性毒剂生物标志物检测的技术方法  18-21
    2.1 神经性毒剂原型的检测方法  18
    2.2 神经性毒剂水解产物的检测方法  18-19
    2.3 神经性毒剂加合物的检测方法  19-21
      2.3.1 神经性毒剂与ChE 加合物的检测方法  19-21
      2.3.2 神经性毒剂与白蛋白加合物的检测方法  21
  3. 神经性毒剂生物标志物检测的研究现状及挑战  21-22
  4. 本课题的研究目的及研究内容  22-24
    4.1 课题研究目的  22
    4.2 课题研究内容  22-24
第二章 神经性毒剂与白蛋白加合物参考品及其氘代内标物的合成  24-37
  1. 引言  24-26
    1.1 O-烷基甲基膦酰氯的合成  25
    1.2 酪氨酸N 端，C 端羟基的保护  25-26
    1.3 O-烷基甲基膦酰化酪氨酸的合成  26
  2. 实验部分  26-30
    2.1 实验仪器和设备  26
    2.2 实验药品和试剂  26-27
    2.3 实验方法  27-30
      2.3.1 O-烷基甲基膦酰氯的合成  27-28
        2.3.1.1 O-烷基甲基膦酰氯的合成  27-28
        2.3.1.2 O-乙基-N,N-二甲基膦酰氯的合成  28
        2.3.1.3 GC-MS 检测O-烷基甲基膦酰氯的合成产物  28
      2.3.2 酪氨酸N 端、C 端的保护  28-29
      2.3.3 膦酰化酪氨酸的合成  29
      2.3.4 O-烷基甲基膦酰化酪氨酸纯化  29-30
      2.3.5 O-烷基甲基膦酰化酪氨酸催化氢化脱保护  30
  3. 结果与讨论  30-36
    3.1 O-烷基甲基膦酰氯的合成  30-32
    3.2 酪氨酸N 端、C 端的保护  32
    3.3 膦酰化酪氨酸的合成  32-36
      3.3.1 膦酰化N,C-保护酪氨酸的合成  32-34
      3.3.2 膦酸化N,C-保护酪氨酸的纯化  34
      3.3.3 膦酸化N,C-保护酪氨酸的脱保护  34-36
  4 本章小结  36-37
第三章 神经性毒剂与白蛋白加合物体外分析方法的建立  37-57
  1. 引言  37-38
  2. 实验部分  38-43
    2.1 实验仪器与设备  38-39
    2.2 实验药品和试剂  39-40
    2.3 实验方法  40-43
      2.3.1 应用O-烷基甲基膦酰化酪氨酸参考品对分析方法进行优化  40-41
        2.3.1.1 LC-Q-TOF MS/MS 参数的优化  40
        2.3.1.2 固相萃取方法的优化  40-41
      2.3.2 神经性毒剂体外染毒样品中白蛋白加合物的测定  41-43
        2.3.2.1 神经性毒剂贮备溶液的配制  41
        2.3.2.2 神经性毒剂对人血清的体外染毒  41-42
        2.3.2.3 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中BuChE 活性抑制率的测定  42
        2.3.2.4 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白的提取  42
        2.3.2.5 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白加合物的酶解  42-43
        2.3.2.6 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白酶解体系的SPE 方法  43
        2.3.2.7 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白加合物的LC-Q-TOF MS  43
  3. 结果与讨论  43-55
    3.1 应用膦酰化酪氨酸参考品及其氘代内标物对分析方法进行优化  43-47
      3.1.1 LC-Q-TOF MS/MS 条件的优化  43-46
        3.1.1.1 质谱参数的优化  43-44
        3.1.1.2 LC 方法的优化  44-46
      3.1.2 固相萃取方法的优化  46-47
    3.2 神经性毒剂体外染毒样品中白蛋白加合物的测定  47-51
      3.2.1 神经性毒剂与人血清白蛋白的加合  47
      3.2.2 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中BuChE 活性抑制率的测定  47-49
      3.2.3 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白的提取  49
      3.2.4 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白的酶解  49-50
      3.2.5 神经性毒剂-人血清体外染毒样品中白蛋白加合物的LC-Q-TOF MS/MS 检测  50-51
    3.3 梭曼-白蛋白加合物的新检测靶分子—梭曼-二肽加合物  51-55
      3.3.1 新检测靶分子的发现及结构确证  51-53
      3.3.2 新检测靶分子梭曼-二肽加合物的固相萃取方法优化  53
      3.3.3 新检测靶分子梭曼-二肽加合物的酶解条件  53-54
      3.3.4 以梭曼-二肽加合物作为检测靶分子的灵敏度及线性  54-55
  4. 本章小结  55-57
第四章 神经性毒剂与白蛋白加合物同位素稀释定量分析方法的建立  57-69
  1. 引言  57-58
  2. 实验部分  58-63
    2.1 实验仪器与设备  58-59
    2.2 实验药品和试剂  59
    2.3 实验方法  59-63
      2.3.1 基质溶液的制备  59-60
      2.3.2 LC-Triple quadrupole MS/MS 参数的优化  60-61
        2.3.2.1 质谱参数的优化  60
        2.3.2.2 LC 参数的优化  60-61
      2.3.3 精密度的测定  61
      2.3.4 回收率的测定  61-62
      2.3.5 灵敏度的测定  62
      2.3.6 工作曲线的绘制  62-63
  3. 结果与讨论  63-68
    3.1 LC-Triple quadrupole MS/MS 参数的优化  63-64
      3.1.1 质谱参数的优化  63-64
      3.1.2 液相参数的优化  64
    3.2 精密度的测定  64-65
    3.3 工作曲线的绘制  65-66
    3.4 回收率的测定  66-67
    3.5 灵敏度的测定  67-68
  4. 本章小结  68-69
第五章 神经性毒剂染毒动物实验样品中白蛋白加合物的定量检测  69-76
  1. 引言  69-70
  2. 实验部分  70-73
    2.1 实验仪器与设备  70-71
    2.2 实验药品和试剂  71
    2.3 实验动物  71
    2.4 实验方法  71-73
      2.4.1 神经性毒剂贮备溶液的配制  71-72
      2.4.2 实验动物  72
      2.4.3 动物染毒实验  72
      2.4.4 动物染毒样品中BuChE 活性抑制率的测定  72
      2.4.5 动物染毒样品中白蛋白的提取  72-73
      2.4.6 动物染毒样品中白蛋白的酶解  73
      2.4.7 动物染毒样品中白蛋白酶解体系的SPE 方法  73
      2.4.8 动物染毒样品中神经性毒剂-酪氨酸加合物的LC-MS/MS 分析  73
  3. 结果与讨论  73-74
    3.1 动物染毒实验  73
    3.2 动物染毒样品中BuChE 活性抑制率的测定  73-74
    3.3 动物染毒样品中神经性毒剂-酪氨酸加合物的LC-MS/MS 分析  74
  4. 本章小结  74-76
第六章 神经性毒剂与丁酰胆碱酯酶加合物体外分析方法的建立  76-89
  1. 引言  76-77
  2. 实验部分  77-82
    2.1 实验仪器与设备  77-78
    2.2 实验药品和试剂  78-79
    2.3 实验方法  79-82
      2.3.1 procainamide-sepharose 4B 亲和凝胶的制备  79-80
        2.3.1.1 溴化氰对sepharose 4B 凝胶的活化  79
        2.3.1.2 CH-sepharose 4B gel 的制备  79
        2.3.1.3 procainamide 的连接  79
        2.3.1.4 procainamide 与sepharose 4B gel 结合率的测定  79-80
        2.3.1.5 procainamide-sepharose 4B gel 对人血清中BuChE 提取回收率的测定  80
      2.3.2 梭曼与人血清体外染毒体系的制备  80
        2.3.2.1 梭曼贮备溶液的配制  80
        2.3.2.2 梭曼对人血清的染毒  80
      2.3.3 梭曼-人血清体外染毒体系中膦酰化BuChE 的分离纯化  80-81
      2.3.4 梭曼-人BuChE 加合物的酶解和富集  81
      2.3.5 LC-Q-TOF MS 分析  81
      2.3.6 梭曼-人血清染毒体系中BuChE 和白蛋白加合物的同时测定  81-82
        2.3.6.1 梭曼-人血清染毒体系中先提取白蛋白加合物再提取BuChE 加合物  81
        2.3.6.2 梭曼-人血清染毒体系中先提取BuChE 加合物再提取白蛋白加合物  81-82
  3. 结果与讨论  82-87
    3.1 procainamide-sepharose 4B 亲和凝胶的制备  82
    3.2 procainamide-sepharose 4B gel 对人血清中BuChE 提取回收率的测定  82-83
    3.3 梭曼-人血清体外染毒体系中梭曼-BuChE 加合物的测定  83-85
    3.4 梭曼-人血清染毒体系中BuChE 和白蛋白加合物的同时测定  85-87
  4. 本章小结  87-89
结论  89-91
参考文献  91-98
附录一 神经性毒剂体内生物标志物分析方法的研究进展  98-108
附录二 个人简历  108-109
附录三 博士在读期间发表文章  109

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