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芥子气染毒体内谷胱甘肽加合物β-裂解产物的检测方法研究

作　者: 董媛
导　师: 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析
关键词: 芥子气谷胱甘肽加合物生物标志物 GC-MS SPE SLE
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

芥子气(sulfur mustard,SM)是一种糜烂性化学毒剂,可引起接触部位的中毒反应,如组织糜烂、皮肤粘膜溃烂、坏死等症状,进入体内则引起全身性中毒反应。芥子气是一种双功能烃基化分子,在体内能迅速与亲核基团发生反应,如与DNA、蛋白质、酶、谷胱甘肽等生物活性分子结合,其中与谷胱甘肽形成加合物后,经β-裂解酶酶解生成无毒的代谢物,如SBMTE, MSMTESE和SBMSE等,随尿液排出体外,这是代谢消除最快的一条途径。由于此类化合物在健康人体尿液中不存在,因此它们可以作为芥子气暴露人员体内的特异性生物标志物,为芥子气中毒的确证和溯源性核查提供重要依据。本论文应用SPE、SLE样品前处理技术,对染毒尿样中SBMTE的提取净化过程做了详细研究,应用气相色谱-质谱联用技术,建立了芥子气-谷胱甘肽加合物β-裂解产物的分析方法。全文共分为5章。第一章为前言部分。介绍了芥子气中毒后体内代谢过程,对各个代谢路径的加合物检测方法和样品制备进行了综述,评述了关于芥子气-谷胱甘肽加合物β-裂解产物的检测在芥子气核查中的重要意义,并在此基础上提出论文的研究内容和创新点。第二章是染毒尿样中SBMTE前处理方法的研究。本章基于SPE、SLE技术,建立了多种体外人工染毒尿样中SBMTE的提取净化方法。其中SPE(PEP)方法适用于尿样中人工添加SBMTE的直接提取净化,其它几种方法中增加了三氯化钛还原步骤,适用于芥子气-谷胱甘肽加合物β-裂解酶酶解的总代谢产物(SBMSE、MSMTESE和SBMTE等)的提取净化。由于在还原反应后加碱生成了大量沉淀,样品由复杂的尿样转变为更复杂的固液混悬体系,为样品前处理带来更大的困难。基于液-液萃取原理的SLE方法采用了两种上样方式,即悬浊液上样SLE(I)和上清液上样SLE(II),前者的优势在于高的回收率,大于90%,适用于低浓度基质较简单的人工尿样的处理;后者因沉淀吸附造成回收率严重损失,近30%,但提高了样品的净化效果,适用于中高浓度基质复杂的实际尿样的处理。SPE(HLB)方法是SLE方法的改进,虽然采用上清液上样方式,提取回收率较低,但是实现了样品的有效净化,完全消除了杂质干扰,同时实现了高倍数浓缩,从而大大提高了方法的灵敏度,适用于低浓度基质复杂的实际尿样的处理。第三章,检测尿样中SBMTE的仪器分析方法的研究。本章运用GC-MS(EI)、GC-MS(CI)和GC-MS/MS(EI)等现代仪器检测技术,结合不同的样品前处理方法建立了染毒尿样中SBMTE的多种分析检测方法。GC-MS(EI)检测方法分别运用了SPE(PEP)、SLE(I)和SPE(HLB)等三种前处理方法,第一种方法处理过程较简单,检测限为0.1 ng/mL,该方法未经还原,只适用于人工添加SBMTE尿样的检测,并只用GC-MS(EI)建立了检测方法。后两种方法增加了还原反应步骤,检测限均为0.5 ng/mL,不同点在于SLE(I)方法回收率高,SPE(HLB)方法净化效果更好,更适合于复杂基质样品的检测。GC-MS(CI)检测方法运用了两种前处理方法SLE(II)和SPE(HLB),前者的方法灵敏度较差为25 ng/mL,后者的方法灵敏度为5 ng/ml,灵敏度有所提高但是与EI源质谱检测器的灵敏度相比降低为原来的十分之一。GC-MS/MS(EI)检测方法只运用了SPE(HLB)前处理方法,检测限达到0.02 ng/ml,是检测尿样中SBMTE最灵敏、可靠、稳定的方法。第四章为经皮染毒动物模型的建立及谷胱甘肽加合物代谢行为的研究。给予家兔高、中、低三个剂量的芥子气皮肤染毒后,按时采集尿样,运用已经建立的方法检测动物实际染毒后尿样中的SBMTE,从而建立了动物染毒后尿样中SBMTE的时效关系。对动物中毒后四周的尿样进行检测,实验结果表明,芥子气中毒后体内芥子气-谷胱甘肽加合物消除迅速,染毒后第一、二天尿样中SBMTE含量处于高水平,第3天急剧下降,仅约为第一天浓度水平的30%,到第七天SBMTE的浓度下降到第一天的4%以下;第一周代谢消除量达到四周消除总量的99%以上。一周之后动物体内的谷胱甘肽加合物β-裂解产物在低浓度水平能维持较长时间,高剂量组在第28天仍有高于定量限三倍以上的检出量,中剂量组在第24天的检出量为检测限水平,低剂量组在第21天的检出量为检测限水平。因此芥子气中毒后谷胱甘肽加合物溯源性检测时间可以延长至21～28天。第五章为方法的实际应用——中毒人员的确证。我们将建立的芥子气染毒体内尿样中芥子气-谷胱甘肽加合物β-裂解产物的检测方法成功应用于2011年某日发生在某建筑工地的意外中毒人员尿样的检测中,为患者的确证提供了有力依据。中毒后第8天患者尿样中SBMTE的检出量为检测限水平。同时证明我们建立的方法具有实际应用的价值。

全文目录

英文缩写  7-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章前言  13-21
  1.1 芥子气中毒体内的生物标志物及检测方法  13-17
    1.1.1 芥子气-谷胱甘肽加合物  13-15
    1.1.2 芥子气水解产物  15
    1.1.3 芥子气-蛋白质加合物  15-16
      1.1.3.1 芥子气-蛋白加合物测方法  15-16
    1.1.4 芥子气-DNA 加合物  16-17
      1.1.4.1 芥子气-DNA 加合物检测方法  16-17
  1.2 样品的制备  17-19
    1.2.1 固相萃取（SPE）  17-18
    1.2.2 固相支持液-液萃取（SLE）  18
    1.2.3 酶解和水解  18-19
    1.2.4 衍生化  19
  1.3 本论文的创新点与研究工作  19-21
第二章 SBMTE 染毒尿样前处理方法的研究  21-35
  2.1 引言  21
  2.2 实验部分  21-27
    2.2.1 仪器与试剂  21-22
    2.2.2 SBMTE 标准品的合成及鉴定  22
    2.2.3 标准溶液及样品的配制  22
      2.2.3.1 标准溶液的配制  22
      2.2.3.2 染毒尿样的配制  22
      2.2.3.3 内标溶液的配制  22
    2.2.4 仪器分析条件  22-23
      2.2.4.1 GC-MS(EI)分析条件  22-23
      2.2.4.2 GC-MS(CI)分析条件  23
    2.2.5 染毒尿样的样品前处理方法  23-27
      2.2.5.1 染毒尿样中SBMTE 的直接提取净化方法——SPE(PEP)  23-24
      2.2.5.2 染毒尿样还原后固相支持液-液萃取提取净化方法——SLE(I)  24-25
      2.2.5.3 染毒尿样还原后固相支持液-液萃取提取净化方法——SLE(II)  25-26
        2.2.5.3.1 染毒尿样还原反应条件的确定  25
        2.2.5.3.2 固相支持液-液萃取提取净化方法——SLE(II)  25-26
      2.2.5.4 染毒尿样还原后固相萃取净化方法——SPE(HLB)  26-27
  2.3 样品前处理条件的优化及实验结果  27-33
    2.3.1 染毒尿样中直接提取SBMTE 固相萃取SPE(PEP)条件的优化  27-29
      2.3.1.1 SPE 小柱的选择  27-28
      2.3.1.2 SPE 洗脱液及淋洗液的优化  28-29
    2.3.2 染毒尿样还原后固相支持液-液萃取SLE(I)条件的优化  29-30
      2.3.2.1 SLE(I)上样方式的选择  29
      2.3.2.2 Chem Elute 小柱型号的选择  29-30
      2.3.2.3 SLE(I)洗脱液的优化  30
    2.3.3 染毒尿样还原后固相支持液-液萃取SLE(II)条件的优化  30-31
      2.3.3.1 SLE(II)上样方式的选择  30-31
      2.3.3.2 Chem Elut 小柱型号的选择  31
    2.3.4 染毒尿样还原后固相萃取SPE(HLB)条件的优化  31-33
      2.3.4.1 SPE 小柱的选择  31-32
      2.3.4.2 SPE 上样方式的选择  32
      2.3.4.3 固相萃取淋洗液和洗脱液的优化  32-33
  2.4 结果讨论  33-34
  2.5 本章小结  34-35
第三章染毒尿样中SBMTE 的仪器分析方法研究  35-51
  3.1 引言  35
  3.2 实验部分  35-38
    3.2.1 仪器与试剂  35
    3.2.2 仪器分析方法  35-36
      3.2.2.1 GC-MS(EI)分析条件  35-36
      3.2.2.2 GC-MS(CI)分析条件  36
      3.2.2.3 GC-MS/MS(EI)分析条件  36
    3.2.3 仪器分析条件的优化  36-38
      3.2.3.1 GC-MS(EI)分析条件的优化  36-37
      3.2.3.2 GC-MS(CI)仪器条件的优化  37
      3.2.3.3 GC-MS/MS (EI) 仪器条件的优化  37-38
  3.3 实验结果  38-49
    3.3.1 GC-MS (EI)分析方法的实验结果  38-42
      3.3.1.1 GC-MS (EI)联用仪检测SBMTE 标准曲线的建立  38
      3.3.1.2 GC-MS (EI)检测染毒尿样中SBMTE 的线性范围和检出限  38-41
      3.3.1.3 GC-MS (EI) 检测染毒尿样中SBMTE 的方法回收率和精密度  41-42
      3.3.1.4 GC-MS(EI)基质效应  42
    3.3.2 GC-MS (CI)分析方法的实验结果  42-46
      3.3.2.1 GC-MS (CI)检测SBMTE 标准曲线的建立  42
      3.3.2.2 GC-MS(CI)检测染毒尿样中SBMTE 的工作曲线及检出限  42-45
      3.3.2.3 GC-MS (CI)方法检测染毒尿样中SBMTE 的回收率和精密度  45
      3.3.2.4 GC-MS (CI)基质效应  45-46
    3.3.3 GC-MS/MS (EI)分析方法的实验结果  46-49
      3.3.3.1 GC-MS/MS (EI)检测SBMTE 标准曲线的建立  46
      3.3.3.2 GC-MS /MS(EI) 检测染毒尿样中SBMTE 的线性范围和检出限  46-48
      3.3.3.3 GC-MS/MS (EI)检测染毒尿样中SBMTE 的回收率和精密度  48
      3.3.3.4 GC-MS/MS(EI)基质效应  48-49
  3.4 结果讨论  49-50
  3.5 本章小结  50-51
第四章经皮染毒动物模型的建立及谷胱甘肽加合物代谢行为的研究  51-60
  4.1 引言  51
  4.2 实验部分  51-52
    4.2.1 仪器与试剂  51
    4.2.2 标准溶液及样品的配制  51-52
      4.2.2.1 SBMTE 标准溶液的配制  51
      4.2.2.2 SBMTE 控制样的配制  51-52
      4.2.2.3 内标液的配制  52
    4.2.3 动物的皮肤染毒  52
    4.2.4 动物尿样的采集与储存  52
    4.2.5 动物尿样的检测  52
    4.2.6 尿样中SBMTE 稳定性的考察  52
  4.3 实验结果  52-58
    4.3.1 GC-MS/MS(EI) 检测染毒动物尿样中SBMTE 的线性范围和检出限  52-53
    4.3.2 GC-MS/MS (EI)检测染毒动物尿样中SBMTE 的回收率和精密度  53
    4.3.3 动物尿样的基质效应  53-54
    4.3.4 尿样中SBMTE 的稳定性  54-55
      4.3.4.1 尿样中SBMTE 的室温稳定性  54
      4.3.4.2 仪器进样前SBMTE 稳定性的考察  54
      4.3.4.3 冻融稳定性  54-55
      4.3.4.4 染毒尿样中SBMTE 冻存稳定性的考察  55
    4.3.5 动物皮肤染毒实验的结果  55-58
      4.3.5.1 动物染毒后SBMTE 浓度随时间变化趋势  55-56
      4.3.5.2 动物染毒后SBMTE 排出量随时间变化趋势  56-58
  4.4 结果讨论  58-59
  4.5 本章小结  59-60
第五章方法的实际应用——中毒人员的确证  60-65
  5.1 引言  60
  5.2 实验部分  60-61
    5.2.1 仪器与试剂  60
    5.2.2 标准溶液及控制样的配制  60-61
      5.2.2.1 SBMTE 标准溶液的配制  60
      5.2.2.2 SBMTE 控制样的配制  60-61
      5.2.2.3 内标液的配制  61
    5.2.3 患者尿样的采集与储存  61
    5.2.4 患者尿样的检测  61
  5.3 检测结果  61-63
    5.3.1 定性结果  61
    5.3.2 定量结果  61-63
  5.4 结果讨论  63-64
  5.5 本章小结  64-65
结论  65-66
参考文献  66-69
文献综述  69-83
  参考文献  78-83
个人简历  83-84
致谢  84

芥子气染毒体内谷胱甘肽加合物β-裂解产物的检测方法研究

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