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宾赛克嗪对突触后膜胆碱能受体功能拮抗作用的研究

作　者: 张捷
导　师: 汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: M受体 N受体胆碱酯酶抑制剂宾赛克嗪颈上交感神经元
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胆碱酯酶抑制剂（ChEI）,即有机磷毒物（OP）不仅被用于现代战争和恐怖事件,还产生重大的职业危害。ChEI中毒机理及其特效抗毒剂的研究意义重大。宾赛克嗪是本实验室研发的一种兼具M、N受体双靶向的速效强效抗毒剂。本实验室前期研究发现:1.在OP中毒过程中,失敏后的N受体不但有悖于传统观点所言处于无功能状态,而且还能通过易化M受体对激动剂的敏感性而增强OP的毒性效应,这为宾赛克嗪抗N作用的研究及其重要性提供了理论依据;2.在配体结合实验中,宾赛克嗪对M受体的亲和力远弱于阿托品,而在动物实验中,宾赛克嗪的抗致死作用强于阿托品,这为宾赛克嗪抗N作用的研究及其重要性提供了实验依据。同时,本实验室系列研究表明,并非抗毒剂的作用强度越强,抗毒效果越好,而是抗M、N作用强度的比例关系在一定范围内,其抗毒作用最强。本研究的目的在于明确判断宾赛克嗪拮抗M、N受体的作用强度和特点,并对其拮抗M、N受体强度的比例关系进行分析。本实验选用培养的新生大鼠颈上交感神经元为模型,由于接受节前胆碱能神经纤维的支配,其膜表面存在着大量N受体,同时也有M受体分布,适于本实验要求。采用具有高灵敏度,能够记录直观反映细胞膜电活动指标的膜片钳全细胞记录技术。选取宾赛克嗪对烟碱激动N受体诱发电流的抑制作用为指标,考察宾赛克嗪对N受体功能拮抗作用的强度及其作用特点,并用美加明作对照。选取宾赛克嗪对M受体（M1亚型）介导的IM-抑制的拮抗作用,对M受体（M2/M4亚型）介导的IKV-增强的拮抗作用为指标,考察宾赛克嗪对M受体功能拮抗作用强度,并用阿托品作对照。并在此基础上分析宾赛克嗪抗M、N受体的比例关系。同时,由于在中毒过程中N受体长期处于失敏状态,中毒症状主要表现为M样毒性反应。然而,在N受体失敏状态下,拮抗剂对M受体功能的拮抗作用强度很难精确判断。本研究首次在胆碱能突触模型（大鼠颈上交感神经元）上应用电生理技术研究N受体失敏对宾赛克嗪拮抗M受体功能作用的影响,并用阿托品作对照。研究宾赛克嗪对突触后膜胆碱能受体功能拮抗作用特征不仅有助于阐明其抗毒分子机制,而且为针对胆碱能神经功能紊乱相关疾病和ChEI中毒的新药的发现和评价提供了新的参考。上述研究获得的主要结果如下:一.交感神经元的形态学和功能鉴定本实验采用的原代培养的Wistar乳鼠外周颈上交感神经节神经元（SCG）上同时含有M、N受体,而且大部分是胆碱能受体,是研究药物对M、N受体功能拮抗作用的理想模型。1.培养的新生大鼠交感神经元的形态学观察在本实验条件下,培养的新生大鼠SCG神经元生长良好,且细胞膜表面清洁,适合膜片钳实验研究。2.交感神经元表达的电压依赖性离子通道使用全细胞记录方法证明,培养的SCG神经元表达了钠、钾、钙等电压依赖性离子通道,建立了对烟碱受体激动剂的稳定反应性。二.宾赛克嗪对交感神经元N受体功能拮抗作用及其作用位点的研究1.交感神经元的烟碱诱发电流及其量效关系通过压力喷射给药的方式给予神经元不同浓度的激动剂,诱发的内向电流幅度逐渐增大并且具有浓度依赖性。激动剂（烟碱）的EC50为:77.1μmol·L^-1。2.宾赛克嗪对烟碱激动N受体诱发电流的抑制作用宾赛克嗪对烟碱诱发的内向电流有明显的抑制作用,且该抑制作用具有可逆性和浓度依赖性,IC50±L95值为12.74±3.16μmol·L^-1,b±Sb值为2.43±0.58。美加明对烟碱诱发的内向电流有明显的抑制作用,且该抑制作用具有可逆性和浓度依赖性,IC50±L95值为9.82±2.73μmol·L^-1,b±Sb值为2.16±1.03。3.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的可逆性宾赛克嗪和美加明对nAChRs介导的全细胞电流的抑制作用均具有可逆性,其中美加明恢复迅速,但不完全;宾赛克嗪恢复迅速,而且完全。4.宾赛克嗪对神经元N受体失敏的影响宾赛克嗪和美加明都使nAChRs失敏的时间常数τs减小（P<0.01）,宾赛克嗪和美加明均能加速nAChRs失敏。5.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的电压依赖性宾赛克嗪和美加明抑制nAChRs的作用均具有电压依赖性。6.宾赛克嗪对神经元N受体介导电流阻断作用的使用依赖性宾赛克嗪和美加明抑制nAChRs介导的全细胞电流均具有使用依赖性。上述结果提示,宾赛克嗪和美加明对nAChRs介导的全细胞电流峰值均有明确的抑制作用,且该抑制作用均与宾赛克嗪或美加明的使用浓度之间存在量效关系。宾赛克嗪对nAChRs介导的全细胞电流峰值的抑制作用与美加明相当。宾赛克嗪和美加明对nAChRs介导的全细胞电流的抑制作用均具有可逆性,均可加速nAChRs功能衰减,并同时具有电压依赖性和使用依赖性。表明宾赛克嗪和美加明的作用位点可能在nAChRs开放离子通道的内部,为离子通道阻断剂。三.宾赛克嗪对M受体功能拮抗作用的研究1.宾赛克嗪对M受体（M1亚型）功能的拮抗作用给予宾赛克嗪后氧化震颤素对IM的抑制率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为4.13±1.27μmol·L^-1,b±Sb值为-2.05±0.81。给予阿托品后氧化震颤素对IM的抑制率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为1.32±0.45μmol·L^-1,b±Sb值为-2.67±0.59。2.宾赛克嗪对M受体（M2/M4亚型）功能的拮抗作用给予宾赛克嗪后氧化震颤素对IKV的增强率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为6.30±1.93μmol·L^-1,b±Sb值为-2.15±0.61。给予阿托品后氧化震颤素对IKV的增强率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为2.56±0.87μmol·L^-1,b±Sb值为-2.24±0.42。上述结果表明,宾赛克嗪和阿托品对mAChRs（M1亚型）的功能均有剂量依赖性拮抗作用。宾赛克嗪的拮抗作用弱于阿托品,其IC50值是阿托品IC50值的3.13倍。宾赛克嗪和阿托品对mAChRs（M2/M4亚型）的功能均有剂量依赖性拮抗作用。宾赛克嗪的拮抗作用弱于阿托品,其IC50值是阿托品IC50值的2.46倍。四.神经元N受体功能失敏对宾赛克嗪拮抗M受体作用的影响1.N受体失敏状态下宾赛克嗪对M受体功能的拮抗作用N受体失敏状态下,给予宾赛克嗪后氧化震颤素对IM的抑制率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为52.28±9.76μmol·L^-1,b±Sb值为-3.54±1.98。N受体失敏状态下,给予阿托品后氧化震颤素对IM的抑制率明显降低,且该降低作用呈现浓度依赖性,IC50±L95值为43.17±11.43μmol·L^-1,b±Sb值为-1.17±0.15。2.N受体的失敏程度对宾赛克嗪拮抗M受体作用的影响随着N受体失敏程度逐渐减弱,宾赛克嗪和阿托品对M受体功能的拮抗作用强度也呈逐渐恢复的趋势。同时,随着N受体的恢复,宾赛克嗪对M受体功能的拮抗作用逐渐弱于阿托品。3.宾赛克嗪对M、N受体功能拮抗作用强度的比例关系的分析宾赛克嗪对nAChRs功能的拮抗作用与美加明相当,对mAChRs功能的拮抗作用弱于阿托品。宾赛克嗪对mAChRs的拮抗作用强度强于nAChRs,其强度之比为2:1³.1:1。上述结果表明,与正常状态相比,在N受体失敏状态下,宾赛克嗪和阿托品对M受体功能的拮抗作用强度均显著减弱,且宾赛克嗪减弱的幅度小于阿托品。随着N受体逐渐从失敏状态恢复到正常状态,宾赛克嗪和阿托品对M受体功能的拮抗作用强度也呈逐渐恢复的趋势。综上所述,本研究结论如下:1.宾赛克嗪和美加明对nAChRs介导的全细胞电流峰值均有剂量依赖性的抑制作用,宾赛克嗪的抑制作用与美加明相当。宾赛克嗪和美加明对nAChRs介导的全细胞电流的抑制作用均有可逆性,美加明恢复迅速,但不完全;宾赛克嗪恢复迅速,而且完全。该抑制作用均可加速nAChRs功能衰减,并同时具有电压依赖性和使用依赖性。表明宾赛克嗪和美加明的作用位点可能在nAChRs开放离子通道的内部,为离子通道阻断剂。2.宾赛克嗪和阿托品对mAChRs（M1亚型）的功能均有剂量依赖性拮抗作用。宾赛克嗪的拮抗作用弱于阿托品,其IC50值是阿托品IC50值的3.67倍。宾赛克嗪和阿托品对mAChRs（M2/M4亚型）的功能均有剂量依赖性拮抗作用。宾赛克嗪的拮抗作用弱于阿托品,其IC50值是阿托品IC50值的2.46倍。3.与正常状态相比,在神经元nAChRs失敏状态下,宾赛克嗪和阿托品对mAChRs功能的拮抗作用强度均显著减弱,且宾赛克嗪减弱的幅度小于阿托品。随着nAChRs逐渐从失敏状态恢复到正常状态,宾赛克嗪和阿托品对mAChRs功能的拮抗作用强度也呈逐渐恢复的趋势。神经元nAChRs失敏使mAChRs拮抗剂对mAChRs功能的拮抗作用强度减弱。4.宾赛克嗪对nAChRs功能的拮抗作用与美加明相当,对mAChRs功能的拮抗作用弱于阿托品。宾赛克嗪对mAChRs的拮抗作用强度强于nAChRs,其强度之比为2:1³.1:1。

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