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IBDV配体表位P22/P221多肽合成功能鉴定及对CEF细胞文库的筛选

作　者: 王睿
导　师: 张改平
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBDV 配体表位噬菌体文库受体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是感染鸡的高致病性并具有接触性的传染病。鸡的法氏囊是该病毒侵染的靶器官。IBDV经典毒株可感染3到6周龄的雏鸡,造成免疫缺陷,进而引起其它病原的感染,出现高死亡率,导致养禽业的巨大经济损失。IBDV基因组编码5种病毒蛋白,其中,VP2是IBDV的主要结构的蛋白,具有重要的作用。根据目前对IBDV VP2蛋白的研究,结合VP2蛋白的空间立体结构,本课题组设计合成了一系列VP2多肽。对该系列VP2配体多肽进行了筛选和鉴定,证实多肽P22是IBDV的配体结合表位,对多肽P22深入分析,得到多肽P22的主要显效部分P221,并具有和多肽P22相同作用。实验设计合成多肽P22和P221,在DT40细胞进行配体表位的研究,进一步应用配体表位多肽和病毒进行受体筛选。本试验为深入研究多肽的生物学功能及用于IBDV的受体研究,用多肽合成仪固相合成多肽P22和P221,并用质谱仪进行鉴定,再用生物素(Biotin)标记多肽与CEF细胞结合的试验来验证P22/P221多肽的生物学功能,证明了本次多肽合成的正确性。IBDV具有感染雏鸡B淋巴细胞的功能,本实验用合成多肽通过Biotin-Avidin-HRP系统分别进行在DT40细胞上的结合试验和病毒阻断结合试验,检测合成多肽在雏鸡B淋巴细胞系(DT40细胞)上的作用效果。试验结果初步说明:多肽P22和多肽P221能够有效地结合DT40细胞,且随着多肽浓度的变化,结合率也随之相应变化。经病毒阻断细胞结合实验发现,多肽P22和多肽P221依然能够有效和DT40细胞结合,但是比起细胞结合试验结果,结合率有明显的下降,经计数结合率约下降70%(P22)和50%(P221)。初步证明IBDV能够有效阻断P22和P221多肽结合DT40细胞。说明多肽P22和P221与鸡B淋巴细胞系能够结合,对深入了解IBDV病毒与靶细胞的相互作用具有一定意义。为研究IBDV病毒与靶细胞的相互作用基础,筛选靶细胞与IBDV的作用分子,分别使用P22和P221混合多肽与IBDV病毒(Xin-1)作为配基,对本实验室设计制备的CEF细胞cDNA T7原核表达文库进行三轮筛选,亲和噬菌体的滴度基本稳定。IBDV筛选三轮的噬菌体滴度分别为:5.3×10~3pfu/mL、3.7×10~6pfu/mL、1.7×10~6 pfu/mL,投入产出比分别为1.9×10~7、2.7×10~4、5.8×10~4。P22筛选三轮的噬菌体滴度分别为:7.0×10~3pfu/mL、2.1×10~6pfu/mL、1.3×10~6pfu/mL,投入产出比分别为1.4×10~7、4.7×10~4、7.6×10~4。通过Phage-ELISA和噬菌斑印迹法初步证明了亲和噬菌体表达蛋白与病毒之间的相互作用。挑选可与IBDV病毒结合的亲和噬菌斑进行PCR扩增测序。经Blast软件分析,由IBDV作为配体筛选出来的亲和噬菌体外源插入序列位于原鸡cDNA序列ChEST898p20上,其最高同源性为97%;由混合多肽作为配体筛选出来的亲和噬菌体外源插入序列位于原鸡胶原蛋白I型α2链的mRNA上,其最高同源性为97%。这些序列表达蛋白可能会是CEF细胞上的IBDV病毒受体结合位点,为下一步深入研究IBDV病毒受体表位奠定了基础。本试验成功合成IBDV的配体结合表位多肽P22和P221,并证实其可同CEF细胞有效结合。通过结合试验和病毒阻断结合试验表明多肽P22和P221可有效和DT40细胞结合,并证明IBDV病毒可阻断多肽和DT40细胞的结合。进一步分别应用配体表位多肽和病毒对CEF细胞cDNA T7原核表达文库进行筛选,得到阳性克隆若干,并筛选出两条序列,待深入研究。

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致谢 4-9中文摘要 9-11Abstract 11-13第一章综述 13-21 1.1 关于 IBDV 13-16 1.1.1 IBDV 的50 年 13 1.1.2 IBDV 的病毒结构 13-15 1.1.3 IBDV 的致病机制 15 1.1.4 VP2 和毒力间的关系 15-16 1.2 研究病毒受体的意义及方法 16-19 1.2.1 病毒受体研究的传统方法 17-18 1.2.2 病毒受体研究的新型生物技术 18-19 1.3 IBDV 受体的研究进展 19-20 1.4 本研究的目的和意义 20-21第二章 P22/P221 多肽合成及功能鉴定 21-35 引言 21 1 材料与方法 21-28 1.1 主要材料 21-22 1.2 主要仪器 22 1.3 多肽合成 22-27 1.4 P22/P221 多肽的生物学功能鉴定 27-28 2 结果与分析 28-30 2.1 P22/P221 多肽的生物学功能鉴定 28-30 3 结论与讨论 30-34 3.1 多肽的设计 30-31 3.2 多肽的合成 31-32 3.3 多肽合成的条件 32 3.4 合成多肽的溶解及保存 32-33 3.5 多肽合成的注意事项 33 3.6 P22/P221 多肽的生物学功能鉴定 33-34 4 小结 34-35第三章 P22/P221 多肽在DT40 细胞上的作用 35-43 引言 35 1 材料与方法 35-37 1.1 主要材料 35 1.2 主要仪器 35-36 1.3 多肽P22/P221 结合 DT40 细胞试验 36 1.4 病毒阻断多肽P22/P221 结合 DT40 细胞试验 36-37 2 试验结果及数据分析 37-40 2.1 P22 结合DT40 细胞实验及病毒阻断试验结果 37-39 2.2 P221 结合DT40 细胞实验及病毒阻断试验结果 39-40 3 结论与讨论 40-42 3.1 标记系统的选择 40 3.2 试验方法的选择 40-41 3.3 试验结果分析 41-42 3.4 试验中的注意事项 42 4 小结 42-43第四章 P22/P221 及IBDV 对 CEF 细胞cDNA 文库的筛选 43-56 引言 43 1 材料与方法 43-48 1.1 主要材料 43-44 1.2 主要仪器 44 1.3 CEF 细胞cDNA 文库扩大并测定滴度 44-45 1.4 CEF 细胞cDNA 文库的生物淘选 45-46 1.5 亲和噬菌体的鉴定 46-47 1.6 亲和噬菌体扩增测序并分析序列 47-48 2 试验结果及数据分析 48-53 2.1 CEF 细胞cDNA 文库扩大并测定滴度 48 2.2 CEF 细胞cDNA 文库的生物淘选 48-50 2.3 噬菌斑印迹法筛选测定亲和噬菌体 50 2.4 Phage-ELISA 检测亲和噬菌体 50-51 2.5 将亲和噬菌体扩增测序并分析序列 51-53 3 结论与讨论 53-55 3.1 CEF 细胞cDNA 文库扩大并测定滴度 53-54 3.2 CEF 细胞cDNA 文库的生物淘选 54 3.3 亲和噬菌体的鉴定 54 3.4 亲和噬菌体扩增测序并分析序列 54 3.5 试验结果分析 54-55 4 小结 55-56全文总结 56-57附录 57-59参考文献 59-65发表论文 65

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