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抗凝血酶在巴斯德毕赤酵母中的表达及优化培养

作　者: 冯秋月
导　师: 许金波; 于群
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 抗凝血酶巴斯德毕赤酵母高通量筛选优化
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抗凝血酶是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(Serine Protease Inhibitor,SERPIN)重要成员之一,通过与凝血酶和因子Xa,IXa,XIa,XIIa等反应形成1:1复合物抑制他们的活性,维持体内凝血与抗凝血的平衡,从而保持正常的生理平衡状态。在正常情况下,抗凝血酶直接的抗凝作用弱且慢,但与肝素结合后,抗凝血酶的活性和抗凝作用显著增强。抗凝血酶主要是由肝细胞分泌的,其血浆含量约为150mg/L。抗凝血酶是分子质量约为58 kD的单链糖蛋白,含有432个氨基酸,3个二硫键,在Asn 96,Asn 135,Asn 155,及Asn 192含有4个糖链,占抗凝血酶总量的10%。抗凝血酶在体内以两种形式存在:?型和?型。其中?型抗凝血酶Asnl35没有糖基化,但其肝素亲和性更高。抗凝血酶承担血浆中70%的生理性抗凝血酶活性,它在血液凝固级联反应和维持血液流动性方面发挥主要调节作用,抗凝血酶的缺乏将易导致血栓形成。因此,抗凝血酶在临床上应用广泛,可有效预防和治疗抗凝血酶缺乏症、弥漫性血管内凝血(DIC)、败血症等严重疾病。目前,临床上使用的抗凝血酶主要来源于血浆提取,由于受到血液制品安全性的限制,致使临床使用成本高昂,病人无法承受。本实验利用基因重组技术表达抗凝血酶,通过培养条件优化提高抗凝血酶活性,为临床应用奠定基础。本论文包括以下2个部分:1抗凝血酶在巴斯德毕赤酵母中的的表达及筛选培养。设计引物以真核表达载体pcDNA3.1-AT为模板通过PCR方法扩增抗凝血酶基因,将双酶切后的抗凝血酶基因与毕赤酵母表达载体pPIC-9K连接转化大肠杆菌DH5?扩增质粒。PCR后将产物测序鉴定质粒中含有抗凝血酶基因。将抗凝血酶表达载体pPIC-9K-AT进行单酶切使其线性化,通过电转转入巴斯德毕赤酵母GS115中。通过平板筛选方法,筛选出活性较高菌株。通过Western blot证明上清中有抗凝血酶的表达,通过两种方法检测上清中抗凝血酶的活性,结果表明两种测活方法检测活性值差异无统计学意义,即两种测活方法均有效。进行BMMY培养基培养时在第8天抗凝血酶活性最高,达到2360 IU/L。2培养条件优化。优化培养温度、培养基pH值、接种比例、甲醇补加浓度及补加时间,BMMY培养基培养上清中活性最终提高到4100IU/L,活性提高了74%。确定最佳培养条件,调整无机培养基中各成分比例,其活性初始为1720IU/L,调整后提高到2980IU/L,提高了73%。

全文目录

英文缩略词表  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-13
第一章抗凝血酶在巴斯德毕赤酵母中的的表达及筛选培养  13-33
  1. 材料  13-16
  2. 方法  16-24
  3. 结果  24-30
  4. 讨论  30-33
第二章菌株的优化培养  33-49
  1. 材料  33-35
  2. 方法  35-37
  3. 结果  37-48
  4. 讨论  48-49
结论  49-51
参考文献  51-55
文献综述  55-61
  参考文献  58-61
发表文章  61-71
个人简历  71-73
致谢  73

抗凝血酶在巴斯德毕赤酵母中的表达及优化培养

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